王云生， 林鵬燕， 徐高倩， 劉振輝

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所， 山東 青島266003)

Gcm(Glialcellsmissing)基因首先于果蠅中被鑒定出來，其編碼一段含Gcm-motif的轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)元前體細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。目前，哺乳動物同源的Gcm也已經(jīng)被分離鑒定出來[4-8]，它們都擁有高度保守的可結(jié)合DNA的Gcm-motif[4]。哺乳動物的Gcm同源基因分為Gcm1和Gcm2兩種類型，主要是在非神經(jīng)組織中表達(dá)，功能多樣[6-8]。例如：小鼠和人的Gcm1基因在胎盤中表達(dá)，參與胎盤中尿囊絨膜的形成[8-10]；然而，Gcm1基因缺失的小鼠腦中星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量并沒有明顯的減少[11]，表明Gcm1的功能在小鼠與果蠅中可能存在差異。小鼠的Gcm2基因表達(dá)在第三咽囊和源自于第三咽囊的甲狀旁腺[6,12]，參與甲狀旁腺的形成[13]；人GCM2基因純合缺失可抑制甲狀旁腺的正常形成及其功能[14]。相似地，雞中的Gcm2基因也主要表達(dá)于咽囊和甲狀旁腺[15]。

不同于陸生脊椎動物，魚類沒有甲狀旁腺，但仍有Gcm2基因的表達(dá)。以硬骨魚斑馬魚為例，Gcm2基因在咽上皮、咽囊 (Pharyngeal pouches)、鰓絲和內(nèi)鰓芽蕾(Internal gill buds)中高表達(dá)，是斑馬魚咽軟骨、鰓絲及內(nèi)鰓芽蕾形成所必需的[16-17]。相似地，軟骨魚狗鯊(Dogfish)的Gcm2基因也在咽囊及由該結(jié)構(gòu)派生出的內(nèi)鰓芽蕾中表達(dá)[15]。Gcm2作為哺乳動物甲狀旁腺發(fā)育的標(biāo)記基因，卻在魚類的鰓相關(guān)結(jié)構(gòu)中高表達(dá)，暗示哺乳動物的甲狀旁腺在進(jìn)化上可能來源于魚類的鰓[15]。另外，還發(fā)現(xiàn)Gcm2基因在斑馬魚的巨噬細(xì)胞中也有表達(dá)[16]。Gcm2在斑馬魚胞外鈣離子平衡的調(diào)控中也發(fā)揮重要的作用[15,18-20]。

以上這些研究表明，不同物種的Gcm基因很可能具有不同的生物學(xué)功能。頭索動物文昌魚是無脊椎動物進(jìn)化到脊椎動物過程中的一個(gè)重要過渡類群，是研究脊椎動物起源與演化的理想的模式生物。本文通過生物信息學(xué)方法從文昌魚基因組鑒定出Gcm同源基因(本文命名為Gcm2-like)，分析了Gcm基因的系統(tǒng)進(jìn)化，并利用RT-PCR和原位雜交技術(shù)對Gcm2-like基因在文昌魚中的表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)其在文昌魚的鰓中高表達(dá)，為深入研究Gcm生物學(xué)功能與進(jìn)化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

青島文昌魚(Branchiostomajaponicum，曾用名B.belcheritsingtauense)，在中國青島市沙子口海域采集獲取。在實(shí)驗(yàn)室每天以單細(xì)胞藻類喂食2次。在實(shí)驗(yàn)開始前，將其在消過毒的過濾海水中進(jìn)行2 d的絕食，以去除腸道內(nèi)的所有食物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取、cDNA第一鏈合成 使用OMEGA公司RNA提取試劑盒提取青島文昌魚不同組織的總RNA，通過Nanodrop儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和質(zhì)量。使用Takara公司cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取各組織cDNA，通過β-actin檢測得到的cDNA 質(zhì)量。β-actin上下游引物為：

F：5′-TCTGGCATCATACCTTCTACAA-3′，R：5′- TCTGTGTCATCTTTTCCCTGTT-3′。

1.2.2 文昌魚Gcm2-like基因的獲取 從NCBI和Ensembl網(wǎng)站獲取斑馬魚、小鼠和人等物種的Gcm氨基酸序列，選擇白氏文昌魚或弗羅里達(dá)文昌魚數(shù)據(jù)庫，通過NCBI-BLAST-protein blast，找到文昌魚的Gcm2-like蛋白的氨基酸序列，并進(jìn)行反向BLAST確認(rèn)。利用primer premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以上述反轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為：

F：5’-AGGGACTGGGACATCAACGA-3’，R：5’-GGTCGTGCGTCCCTTTGG-3’；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 cycles；72 ℃ 7 min；4 ℃ 長期保存。將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-TE載體并轉(zhuǎn)化至DH5α中，對得到的陽性克隆菌進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與白氏文昌魚基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析。

1.2.3Gcm2-like基因序列、結(jié)構(gòu)比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析 對從NCBI中獲取的代表物種Gcm序列的基因結(jié)構(gòu)(外顯子、內(nèi)含子)進(jìn)行對比，分析Gcm基因在進(jìn)化過程中的保守性。用從NCBI和Ensembl網(wǎng)站獲取的其他物種的Gcm氨基酸序列，同文昌魚的Gcm2-like氨基酸序列用MegAlign軟件進(jìn)行對比分析。通過Swiss-Model在線軟件(http://swissmodel.expasy.org/)對Gcm蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。用Sequence Viewer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer/)和Ensembl Genome Browser (http://www.ensembl.org)對代表物種的Gcm的同源基因在染色體上的位置進(jìn)行比較。同時(shí)，截取代表物種Gcm蛋白的Gcm-motif區(qū)域同文昌魚的Gcm2-like的Gcm-motif結(jié)構(gòu)域氨基酸序列用ClustalX軟件進(jìn)行對比分析。通過MEGA7軟件，對不同物種的Gcm蛋白氨基酸序列用Muscle法進(jìn)行比對，對比完成后進(jìn)行1 000次bootstrap，分別利用平均連接聚類法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean，UPGMA)、鄰位相接法(Neighbor Joining，NJ)、最大似然法(Maximum Likelihood，ML)建立關(guān)于Gcm蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 RT-PCR 利用RT-PCR檢測文昌魚Gcm2-like基因在各組織中的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因?yàn)閑f1α基因，引物序列為：F：5′-TGCTGATTGTGGCTGCTGGTGGTACTG -3′，R：5′-GGTGTAGGCCAGCAGGGCGTG-3′。 PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 cycles；72 ℃ 7 min；4 ℃長期保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下拍照觀察。

1.2.5 原位雜交 根據(jù)擴(kuò)增得到的青島文昌魚Gcm2-like基因序列設(shè)計(jì)探針，引物序列為：

F：5’-AGGGACTGGGACATCAACGA-3’，R：5’-GGTCGTGCGTCCCTTTGG-3’。SP6和T7啟動子序列分別加在正向引物和反向引物的5’端。以青島文昌魚cDNA為模板，用合成探針時(shí)所用的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化、測序后，以測序正確的質(zhì)粒為模板，使用Roche公司DIG RNA Labeling kit試劑盒體外轉(zhuǎn)錄獲得Gcm DIG標(biāo)記的RNA正義和反義探針。使用Nanodrop儀檢測探針的濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測探針的質(zhì)量。將文昌魚組織從多聚甲醛溶液(PFA)中取出后，在石蠟切片機(jī)中固定，進(jìn)行切片，切片厚度為8 μm。展片、撈片、烘片具體操作按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 Gcm基因在文昌魚及各物種中的鑒定和結(jié)構(gòu)比較

通過搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)Gcm基因有2種類型Gcm1和Gcm2。Gcm1基因僅在從兩棲類(比如爪蟾)到哺乳動物(比如人)的物種中存在，而Gcm2(或Gcm2-like)基因廣泛存在于從?？鹊偷葻o脊椎動物到哺乳動物的各物種中(見表1)。值得注意的是，節(jié)肢動物的黑腹果蠅、鋸齒果蠅等昆蟲存在2個(gè)Gcm基因(本文分別稱為Gcm2a-like和Gcm2b-like)。它們在染色體上位置相近，而在同是節(jié)肢動物的跳蟻、金刻沃氏蟻和家蠶等僅有一個(gè)Gcm2-like基因，因此，果蠅的這2個(gè)Gcm2-like基因可能是在果蠅的進(jìn)化過程中由一個(gè)Gcm2-like基因的通過復(fù)制產(chǎn)生的。

表1 在不同物種中鑒定到的Gcm基因Table 1 Gcm genes identified in different species

研究還發(fā)現(xiàn)，綠頭鴨Gcm2基因有3個(gè)不同長度的mRNA剪接體(isoform1-3)，其中剪接體isoform1和isoform2編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列僅在N端存在差異，剪接體isoform3編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為isoform1和isoform2剪接體編碼蛋白質(zhì)的一部分。這種一個(gè)Gcm基因有多個(gè)mRNA剪接體的現(xiàn)象在無脊椎動物中更為常見，比如，星狀海葵存在6個(gè)不同的mRNA剪接體，編碼3個(gè)僅在N端有部分差異的蛋白；萼柱珊瑚存在2個(gè)不同的mRNA剪接體，編碼1個(gè)相同的蛋白；棘冠海星存在4個(gè)不同的mRNA剪接體，編碼1個(gè)相同的蛋白；而弗羅里達(dá)文昌魚有6個(gè)不同長度的mRNA剪接體(isoform 1-6)，這6個(gè)轉(zhuǎn)錄本僅在5′端存在差異，其它大部分序列都相同。這6個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼6個(gè)蛋白，它們的氨基酸序列僅有少數(shù)氨基酸不同，其中剪切體isoform 4, isoform5，isoform6編碼的蛋白序列完全一樣，剪切體isoform1編碼的蛋白序列僅比isoform2編碼的蛋白多1個(gè)氨基酸殘基。

通過對人、小鼠、弗羅里達(dá)文昌魚等代表物種Gcm的基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較(見圖1)，我們發(fā)現(xiàn)脊椎動物Gcm1和Gcm2基因結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上較為保守，均含有2個(gè)長度分別為253和113 bp的外顯子；但有一個(gè)明顯不同，即Gcm1基因都有1個(gè)長度為129 bp的外顯子，而在Gcm2基因中其對應(yīng)的外顯子的長度為126 bp。弗羅里達(dá)文昌魚Gcm2-like基因外顯子數(shù)量較脊椎動物多1～2個(gè)，且大多數(shù)外顯子略長一些，但整體上保持了與脊椎動物的Gcm基因結(jié)構(gòu)的相似性。

(弗羅里達(dá)文昌魚Gcm2-like基因與人、小鼠、原雞、爪蟾、斑馬魚Gcm基因的外顯子、內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析。序列來源參見表1。黑色方框代表編碼的外顯子，白色方框代表不編碼的外顯子，直線代表內(nèi)含子。The exon and intron structure analysis of B. floridae Gcm2-like gene and Gcm genes of human, mouse, chicken, xenopus, and zebrafish. See Table 1 for the sequence sources. The black boxes represent encoded exons, the white boxes represent unencoded exons, and the straight lines represent introns.)圖1 弗羅里達(dá)文昌魚Gcm2-like基因與其它代表物種Gcm基因的結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Structural analysis of B. floridae Gcm2-like gene and Gcm genes of other representative species

2.2 Gcm基因的序列、結(jié)構(gòu)及同線性進(jìn)化分析

2.2.1 Gcm-motif結(jié)構(gòu)域進(jìn)化分析 Gcm-motif結(jié)構(gòu)域?yàn)镚cm蛋白的典型結(jié)構(gòu)標(biāo)記，我們從不同門類中選取了幾個(gè)代表物種首先對該結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了序列相似性分析，結(jié)果顯示它們都有典型的Gcm-motif結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，特別是其半胱氨酸在進(jìn)化過程中十分保守(見圖2)。

黑腹果蠅、鋸齒果蠅等蠅類存在的兩種Gcm蛋白的Gcm-motif相似度為71.2%，這兩種Gcm蛋白的Gcm-motif與脊椎動物Gcm2-motif結(jié)構(gòu)域部分相似度為63.6%～67.4%，而與脊椎動物Gcm1-motif結(jié)構(gòu)域部分相似度為57.6%～62.5%(見圖2A)。同樣的，白氏文昌魚Gcm蛋白與脊椎動物Gcm2-motif結(jié)構(gòu)域部分相似性要比與脊椎動物Gcm1-motif結(jié)構(gòu)域部分的相似性略高(見圖2B)，但相差并不很大。

(A：白氏文昌魚Gcm2-like-motif結(jié)構(gòu)域與其它物種Gcm-motif的氨基酸序列用MegAlign軟件進(jìn)行相似性分析。序列來源參見表1。B:人、果蠅、白氏文昌魚Gcm-motif結(jié)構(gòu)域序列用ClustalX進(jìn)行對比分析，保守的氨基酸用#標(biāo)注。A: Similarity analysis of amino acid sequences between the Gcm2-like motif domain of B. belcheri and Gcm-motif of other species was conducted by MegAlign software. See Table 1 for the sequence sources. B: The Gcm-motif domain sequences of human, Drosophila melanogaster and B. belcheri were contrastively analyzed by ClustalX, and the conserved amino acids were labeled with #.)圖2 白氏文昌魚Gcm2-like蛋白與其它物種Gcm蛋白的motif結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比較Fig. 2 Comparison of the amino acid sequence of the motif domain of B. belcheri Gcm2-like protein and Gcm protein of other species

2.2.2 Gcm的蛋白全長序列比對、結(jié)構(gòu)比較及基因在染色體上的同線性分析 將白氏文昌魚Gcm2-like蛋白與代表性物種人、小鼠、原雞、果蠅等Gcm蛋白的全長序列進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示它們的序列相似度并不高(<30%)。其中白氏文昌魚Gcm2-like蛋白與人、小鼠Gcm1蛋白的相似性為26.2%～29.0%，與人、小鼠Gcm2蛋白的相似性為25.1%～27.0%(見圖3A)，顯示白氏文昌魚Gcm2-like并不特別類似Gcm1或Gcm2。

對人Gcm1、Gcm2蛋白與白氏文昌魚的Gcm2-like蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)它們的三維結(jié)構(gòu)都十分相似，其α螺旋和β折疊的數(shù)目均相同(見圖3B)，說明雖然Gcm蛋白序列在進(jìn)化過程中發(fā)生了較大的變化，但其仍然保留了較高的三維結(jié)構(gòu)相似性，這可能對維持其功能的保守性具有重要意義。

另外，對脊椎動物染色體上Gcm位點(diǎn)周圍基因的分析發(fā)現(xiàn)，表1中列出的所有脊椎動物的Gcm1基因位于Cilk1、Fbxo9、Elovl5基因之間，Gcm2基因位于Mak、Sycp2l、Elovl2基因之間(見圖3C)。這些基因位于染色體的相同位置，且順序、方向一致，表明在脊椎動物的進(jìn)化過程中，Gcm基因在染色體上表現(xiàn)出了很好的同線性。類似地，我們發(fā)現(xiàn)，白氏文昌魚Gcm2-like基因在染色體上與sycp2l-like基因位置相臨，這與脊椎動物Gcm2基因在染色體上的位置關(guān)系相似(見圖3C)，暗示文昌魚Gcm2-like為哺乳動物Gcm2的直系同源基因，而Gcm1基因可能是在進(jìn)化過程中由Gcm2基因復(fù)制而來。

(A：白氏文昌魚Gcm2-like蛋白與其它物種Gcm蛋白的氨基酸序列相似性分析。代表物種Gcm全長蛋白的氨基酸序列用MegAlign軟件進(jìn)行對比分析。序列來源參見表1；B：白氏文昌魚Gcm2-like蛋白、人的GCM1及GCM2蛋白預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)比較。通過Swiss-Model在線軟件對Gcm蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；C：用Sequence Viewer和Ensembl Genome Browser對表1列出的所有脊椎動物和白氏文昌魚的Gcm的同源基因在染色體上的位置進(jìn)行比較。方框代表基因，箭頭代表轉(zhuǎn)錄方向。A: Amino acid sequence similarity analysis of Gcm2-like protein of B. belcheri and Gcm protein of other species. The amino acid sequences representing the full-length Gcm protein of the species were analyzed by MegAlign software. See Table 1 for sequence sources; B: Three-dimensional structural comparison of predicted Gcm2-like proteins in B. belcheri, human Gcm1 and Gcm2 proteins. The 3D structure of Gcm protein was predicted by Swiss-Model online software. C: Sequence Viewer and Ensembl Genome Browser were used to compare the locations of homologous genes in Gcm of all vertebrates and amphioxus listed in Table 1 on chromosomes. The boxes represent genes and the arrows represent transcription directions.)圖3 白氏文昌魚Gcm2-like蛋白與其它物種Gcm蛋白的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)比較，以及基因在染色體上的同線性分析Fig. 3 Comparison of the amino acid sequence and three-dimensional structure of B. belcheri Gcm2-like protein and Gcm protein of other species, as well as the analysis of synonymy of genes on chromosomes

2.3 Gcm基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步揭示Gcm基因的進(jìn)化，本文作者基于Gcm-motif結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，利用UPGMA法構(gòu)建包含白氏文昌魚在內(nèi)的多物種Gcm的系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖4)，結(jié)果顯示：兩棲類、鳥類和哺乳動物的Gcm1全部聚為一類，魚類、兩棲類、鳥類和哺乳動物的Gcm2全部聚為一類，無脊椎動物的所有Gcm既不與Gcm1聚為一類，也不與Gcm2聚為一類，而是也全部單獨(dú)聚為一類(見圖4)，而且無脊椎動物的Gcm處于進(jìn)化的基部。本文作者又分別用NJ法和ML法進(jìn)行了進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果基本一致(圖略)。再者，作者基于Gcm蛋白的全長序列分別利用UPGMA法、NJ法和ML法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也支持上述結(jié)果(圖略)。

(通過MEGA7軟件，對不同物種的Gcm-motif氨基酸序列用Muscle法進(jìn)行比對，對比完成后進(jìn)行1 000次bootstrap，利用UPGMA法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。Gcm-motif amino acid sequences of different species were compared with MUSCLE method by MEGA7 software. After comparison, 1 000 Bootstrap was performed, and a phylogenetic tree was established by UPGMA method.)圖4 文昌魚與其他物種Gcm的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Gcm in amphioxus and other species

根據(jù)以上進(jìn)化樹，作者推測無脊椎動物的Gcm可能代表了脊椎動物Gcm兩種類型(Gcm1和Gcm2)分化前的原始形式，無脊椎動物的Gcm沒有Gcm1與Gcm2的分化。再結(jié)合前面的序列相似性比較及基因在染色體上的同線性分析(文昌魚的Gcm基因與脊椎動物的Gcm2基因可能為直系同源基因)，作者認(rèn)為Gcm1基因可能是在進(jìn)化過程中由Gcm2復(fù)制而來，脊椎動物的Gcm2可能更多保留了Gcm原始基因的特征。因此，本文將無脊椎動物的Gcm基因全部稱為Gcm2-like。最早在刺胞動物中發(fā)現(xiàn)Gcm2-like，節(jié)肢動物昆蟲綱環(huán)裂亞目(蠅類)中雖然有兩個(gè)基因，但也都屬于Gcm2-like(本文命名為Gcm2a-like和Gcm2b-like)，魚類中有Gcm2，但未找到Gcm1，兩棲類最先產(chǎn)生Gcm1(見圖5)。

(箭頭代表進(jìn)化方向，方框代表Gcm蛋白類型；昆蟲綱的環(huán)裂亞目(蠅類)有2個(gè)Gcm2-like基因，魚類Gcm1未被發(fā)現(xiàn)。The arrow represents the direction of evolution and the box represents the type of Gcm protein. There are two Gcm2-like genes in Cyclorrhapha (flies) of the class Insecta. Fish Gcm1 has not been found.)圖5 Gcm蛋白由刺胞生物進(jìn)化到哺乳動物簡圖Fig.5 Diagram of the evolution of Gcm protein from cnidaria to mammalia

2.4 青島文昌魚Gcm2-like基因的表達(dá)

2.4.1 青島文昌魚Gcm2-like基因組織分布的RT-PCR檢測 以青島文昌魚組織cDNA為模板,PCR擴(kuò)增Gcm2-like序列，PCR產(chǎn)物測序后經(jīng)BLAST分析確定屬于文昌魚Gcm2-like。利用RT-PCR檢測Gcm2-like在文昌魚各個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Gcm2-like在文昌魚鰓和腸中表達(dá)量最高，肌肉、精巢及脊索的表達(dá)次之，在肝盲囊和卵巢中表達(dá)量最少(見圖6)。

(1：肝盲囊；2：肌肉；3：精巢；4：卵巢；：5：脊索:6：腸；7：鰓。1: Hepatic caecum; 2: Muscles； 3: Testis; 4: Ovaries; 5: Notochord; 6: Intestine; 7: Gills.)圖6 RT-PCR檢測青島文昌魚Gcm2-like基因的組織分布Fig.6 Tissue distribution of Gcm2-like gene in B.japonicum was detected by RT-PCR

2.4.2 原位雜交技術(shù)檢測青島文昌魚Gcm2-like基因的表達(dá) 對青島文昌魚進(jìn)行組織切片，原位雜交顯示Gcm2-like基因在青島文昌魚的鰓、肝盲囊、腸中表達(dá)較高，特別是在鰓中有明顯的高表達(dá)(見圖7)。

((hc:肝盲囊; m:肌肉; hg:后腸; nc:脊索; g:鰓裂，Bar=100 μm。圖A、B為正義探針原位雜交圖(陰性對照);C、D為反義探針原位雜交圖(實(shí)驗(yàn)組)。hc: Hepatic caecum; m: Muscle; hg: Hind-gut; nc: Notochord; g: Gill),Bar=100 μm. A and B are in situ hybridization of the righteous probe (negative control), C and D are in situ hybridization of the antisense probe (experimental group). )圖7 青島文昌魚Gcm2-like基因的切片原位雜交Fig.7 Sectional in situ hybridization of B. japonicum Gcm2-like gene

3 討論

最早發(fā)現(xiàn)的果蠅Gcm有決定神經(jīng)元細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能[1-3]，而其后在哺乳動物中的研究則顯示Gcm同源基因在非神經(jīng)組織表達(dá)[8,11]，這表明脊椎動物的Gcm基因與無脊椎動物的Gcm基因很大可能具有生物學(xué)功能上的差異。文昌魚處于無脊椎動物進(jìn)化至脊椎動物的過渡類型，因此，對文昌魚Gcm基因進(jìn)行研究對于揭示Gcm基因的進(jìn)化具有重要意義。本文通過生物信息學(xué)方法首先對Gcm基因的進(jìn)化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其全長序列在各物種中相似性不高，但其Gcm-motif具有很高的保守性，特別是其Gcm蛋白的三維結(jié)構(gòu)十分相似。我們還通過對基因在染色體上的同線性分析，認(rèn)為文昌魚Gcm2-like為脊椎動物Gcm2的直系同源基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，Gcm基因在進(jìn)化中，由無脊椎動物單一的Gcm2-like基因逐步分化為脊椎動物的Gcm1和Gcm2兩種基因類型。根據(jù)目前的信息，在人、小鼠等哺乳動物及雞、爪蟾等脊椎動物中，兩種類型的Gcm基因都存在，但魚類中只存在Gcm2，沒有發(fā)現(xiàn)Gcm1，魚類的Gcm1基因有可能在進(jìn)化過程中發(fā)生了丟失。

在哺乳動物中，Gcm2基因在咽囊及由此派生出的甲狀旁腺中高表達(dá)，是甲狀旁腺形成所必須的，為甲狀旁腺的標(biāo)記基因[13]。在魚類中，Gcm2表達(dá)在魚類的咽囊及由咽囊派生出的內(nèi)鰓蕾中，是內(nèi)鰓蕾正常形成所必需的[15]。由此，暗示哺乳動物的甲狀旁腺和魚類的內(nèi)鰓蕾為具有關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)，可能有一共同的進(jìn)化史。本文發(fā)現(xiàn)，Gcm2-like基因在文昌魚的肝盲囊、腸、鰓表達(dá)較高，特別是在鰓中表達(dá)明顯，這與Gcm2基因在魚類中的表達(dá)模式相似。因此，Gcm2可能在整個(gè)脊索動物中發(fā)揮保守的功能，這也為哺乳動物的甲狀旁腺在進(jìn)化上可能起源于鰓的假設(shè)提供了新的證據(jù)。

另外，我們的結(jié)果還顯示Gcm2-like基因在文昌魚的肌肉、脊索和神經(jīng)管中也有表達(dá)，盡管表達(dá)相對較低，暗示其可能還具有其它的功能，比如：魚類的鰓在鈣離子攝取中發(fā)揮著重要的作用[18-19]。關(guān)于Gcm基因的更多的生物學(xué)功能有待于進(jìn)一步的研究。