常宗明 張文鐸 尹 花 董建軍

(啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室；青島啤酒股份有限公司，青島 266000)

啤酒高濃釀造是使用比正常濃度更高的麥汁發(fā)酵，在啤酒生產(chǎn)過程后期用水稀釋成正常濃度啤酒的釀造技術(shù)。該技術(shù)在啤酒廠原有設(shè)備基礎(chǔ)上可提高糖化、發(fā)酵等的效率，擴大產(chǎn)量，降低能源消耗，是高效節(jié)能的啤酒釀造新技術(shù)，自20世紀70年代起至今已被廣泛研究和應(yīng)用[1,2]。按照發(fā)酵麥汁濃度分類，正常釀造濃度為10～13 °P，高濃釀造濃度為14～16 °P，而18 °P以上稱之為超高濃釀造。且發(fā)酵濃度越高，生產(chǎn)效率及成本優(yōu)勢越突出[3,4]。

生產(chǎn)高濃度麥汁，增加投料量和在麥汁煮沸時加糖或糖漿提高濃度是最主要的2種方法。第一種方法糖化醪液濃度高，過濾殘?zhí)歉?、麥汁損耗大，工業(yè)化生產(chǎn)麥汁濃度一般不超過14.5 °P，做不到18 °P以上的超高濃度[5]，特別是高比例(≥50%)玉米淀粉的使用會造成麥汁過濾堵塞，延長麥汁過濾時間，影響生產(chǎn)效率[6]。第二種方法，使用糖漿提高濃度，不影響糖化和麥汁過濾，容易工業(yè)化[7]。

適合啤酒釀造用的糖漿類型很多，通常以玉米淀粉為原料，在糖漿廠轉(zhuǎn)化成品后供啤酒廠使用[8,9]。糖漿的制備方法主要有3種：酸解法、酸酶結(jié)合法以及酶法[10]。隨著酶制劑工業(yè)的發(fā)展，酶法制糖因其較高的轉(zhuǎn)化率、溫和的反應(yīng)條件等優(yōu)勢得到了廣泛應(yīng)用，已經(jīng)替代傳統(tǒng)的酸解工藝。趙宇星[11]以玉米淀粉為原料，使用α-淀粉酶、β-淀粉酶及普魯蘭酶協(xié)同糖化制備麥芽糖漿，用于啤酒釀造，但糖化時間長達34 h。Son等[12]對由碎米生產(chǎn)超高濃度麥汁的液化、糖化、發(fā)酵的同步制糖工藝進行了研究。在中試規(guī)模下，使用α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶后，制糖時間由144 h縮短為120 h。然而其中糖漿的制備周期普遍較長，尚無法在啤酒廠內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)化和連續(xù)投料生產(chǎn)[13-15]。

本研究為實現(xiàn)高比例玉米淀粉輔料在超高濃釀造中的應(yīng)用，研究了玉米淀粉多酶法水解工藝，在實驗室條件下，利用單因素實驗和響應(yīng)面實驗優(yōu)化酶制劑組合和添加量，確定制備糖漿的工藝參數(shù)。同時進行中試放大實驗，評估新工藝生產(chǎn)超高濃麥汁及釀制啤酒的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母菌株；大麥芽(加麥Copeland)；小麥芽；玉米淀粉；食品級乳酸；α-淀粉酶(耐高溫型)、酶活力≥120 KNU-S/mL，葡糖淀粉酶(低卡路里型)、酶活力≥400 AGU/mL，普魯蘭酶、酶活力≥400 PUN/mL；無水葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖等試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

D-47055型糊化儀，PB-10 型pH 酸度計，HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，202-3AB 型電熱恒溫干燥箱，Waters Alliance 2695液相色譜儀，1 000 L糖化設(shè)備，2 000 L啤酒發(fā)酵罐。

1.3 方法

1.3.1 超高濃麥汁制備工藝

麥芽在糖化鍋中完成糖化后經(jīng)過濾槽過濾得到的麥汁在煮沸鍋煮沸，在煮沸結(jié)束前10min添加玉米淀粉水解糖漿來提高麥汁濃度，經(jīng)回旋沉淀、冷卻，得到超高濃麥汁。

1.3.2 玉米淀粉水解制備糖漿工藝

如果要在糊化鍋中將淀粉轉(zhuǎn)化為糖漿，實現(xiàn)超高濃麥汁工業(yè)化生產(chǎn)，需滿足：糖漿可發(fā)酵性糖含量應(yīng)與普通麥汁相近；糖漿的制備時間不能過長，否則會限制日投料批次、降低生產(chǎn)效率；要控制酶制劑用量，成本不宜過高。同時，考慮到酶制劑的最適作用溫度以及控制淀粉水解時間在180 min內(nèi)完成的目標，制糖工藝為：

調(diào)漿：糊化儀設(shè)定相關(guān)工藝參數(shù)，將110 g淀粉和50 ℃釀造水，按淀粉：水質(zhì)量比1∶(2.5～3.5)調(diào)漿，加入硫酸鈣0.3 mg/g淀粉，綜合考慮所用酶制劑的最適pH范圍，使用乳酸調(diào)節(jié)pH至5.0～6.0；

一次液化：α-淀粉酶添加量10～30 KNU-S/g淀粉，升溫至70 ℃，實現(xiàn)α-淀粉酶對淀粉液化水解，升溫速率為0.8～1.5 ℃/min，保溫15 min；

糖化：將一次液化好的醪液，加入低于20 ℃的釀造冷水，調(diào)節(jié)醪液溫度為60 ℃，達到葡糖淀粉酶和普魯蘭酶的最適作用溫度，進行協(xié)同糖化，進一步水解成糖。葡糖淀粉酶添加量13-39 AGU/g淀粉，普魯蘭酶添加量0.07～0.28 PUN/g淀粉，糖化時間為80 min；

二次液化：將糖化完畢的醪液，按照升溫速率0.8～1.5 ℃/min，升溫至90 ℃保溫20 min后，進行二次液化，在α-淀粉酶的最適作用溫度下高效分解殘余的難糊化淀粉；

升溫滅酶：將二次液化好的醪液按照0.8～1.5 ℃/min升溫至100 ℃，保溫15 min滅酶，實現(xiàn)糖漿組分的固定化，制得糖漿。

1.3.3 玉米淀粉水解制備糖漿單因素實驗

DE值是還原糖(以葡萄糖計)含量占糖漿干物質(zhì)的百分數(shù)，其大小與淀粉水解程度成正比。DE值的控制實際上是對可發(fā)酵性糖與糊精比例的控制，決定著啤酒可發(fā)酵性和口感等重要因素[16]。因此，本研究選擇以DE值為指標，研究pH、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶及普魯蘭酶的使用對DE值的影響。各單因素水平選擇：pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5；α-淀粉酶添加量分別為60、100、140、180、200 μL；葡糖淀粉酶添加量分別為40、60、80、100、120 μL；普魯蘭酶添加量分別為20、40、60、80、100 μL。

1.3.4 玉米淀粉水解制備糖漿響應(yīng)面優(yōu)化實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以DE值作為評價指標，對酶的添加量進行響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化，利用Design expert 10.0.4軟件進行數(shù)據(jù)分析，并使用獲得的最佳工藝參數(shù)條件，按照1.3.2的工藝進行驗證實驗。

1.3.5 玉米淀粉水解制備糖漿中試放大實驗

按照響應(yīng)面優(yōu)化實驗確定的工藝參數(shù)，進行1 000 L中試放大實驗，研究新的高濃麥汁制備工藝的生產(chǎn)可行性，并進行啤酒發(fā)酵實驗，確定對啤酒口味質(zhì)量等的影響。

1.3.5.1 糖化配方及工藝

糖化配方：原麥汁濃度18 °P；加麥∶小麥芽∶玉米淀粉35%∶15%∶50%。

制糖工藝：同1.3.2。

糖化工藝：麥芽經(jīng)麥芽粉碎機粉碎后投料至糖化鍋，50 ℃休止30 min，65 ℃糖化80 min，醪液碘反應(yīng)合格后升溫至76 ℃進行過濾，麥汁過濾結(jié)束加入適量顆粒酒花煮沸60 min，并且將按照1.3.2方法制備的淀粉糖漿在麥汁煮沸結(jié)束前10 min添加到煮沸鍋中。最后經(jīng)麥汁回旋沉淀槽回旋15min，再經(jīng)薄板冷卻獲得18 °P超高濃麥汁。

1.3.5.2 發(fā)酵工藝

麥汁入發(fā)酵罐時充氧，控制溶解氧13 mg/L，兩批麥汁滿罐，第一批麥汁冷卻時流加青島啤酒選育的高濃酵母，控制滿罐溫度在9.5 ℃，自然升溫至主發(fā)酵溫度11 ℃，當糖度降至5.6 °P后升溫至還原溫度13 ℃，雙乙酰降至50 μg/L時降溫至-1～0 ℃貯酒7 d濾酒。

1.4 分析方法

1.4.1 DE值的測定

水解結(jié)束后立即用雙層定量濾紙過濾，并采用斐林滴定法測定DE值[15]。

1.4.2 糖譜分析

參照Hebeda[17]的方法進行糖譜分析。

1.4.3 理化指標分析

按照ASBC[18]方法對麥汁濃度、色度、α-氨基氮、pH、濁度、總酸、發(fā)酵度等進行測定。

濾酒經(jīng)硅藻土過濾后添加稀釋水稀釋成8 °P，再進行灌裝、殺菌，制得成品，按照標準方法及ASBC方法進行啤酒理化指標的測定[18,19]。

1.4.4 啤酒感官品評

邀請5位國家級專業(yè)品酒委員對啤酒的外觀、成熟度、新鮮度、香氣、可飲性、醇酯風味和酒體共7個維度進行評價。感官評價采用5分制，得分越高表示評價越好。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)值表示為平均值±標準差，單因素實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Design expert 10.0.4進行方差及顯著性分析，采用Origin2018進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米淀粉水解制備糖漿新工藝單因素實驗研究

2.1.1 pH對DE值的影響

由圖1可見，當糖化液pH為5.0時，DE達最高值為50.8±1.8，隨pH的升高，DE值逐漸下降。當糖化液pH低于4.5或高于6.5時，DE值明顯降低(未在圖中體現(xiàn))，且糖化液出現(xiàn)渾濁，碘反應(yīng)不完全。但當pH低于5.5時，由于加酸量過多將導(dǎo)致啤酒口味變酸，影響到口感，因此最終確定pH控制范圍為5.5～6.0。

圖1 糖化液pH值對DE值的影響

2.1.2 酶添加量對DE值的影響

由圖2可見，使用三種酶制劑時，DE值均隨酶添加量的增加而增加。當α-淀粉酶添加量達到140 μL后，DE值變化趨于平穩(wěn)，最高值為41.3±0.8。而當葡糖淀粉酶添加量達到60 μL時，DE值便達到50以上。而當添加量進一步增加至100 μL時，DE值可提高至60以上，最高值為64.5±0.9。當普魯蘭酶添加量為100 μL時，最高值為54.7±1.5，DE值的整體變化趨勢平緩。

圖2 酶添加量對DE值的影響

2.2 玉米淀粉水解制備糖漿新工藝響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.2.1 實驗設(shè)計與結(jié)果

為達到糖漿DE≥50、制糖時間≤180 min設(shè)計目標，采用響應(yīng)面法進行優(yōu)化實驗，選取α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、普魯蘭酶作為影響因子，綜合考慮各因子之間的交互作用對糖化液DE值的影響，根據(jù)單因素實驗結(jié)果設(shè)計3因子3水平，4個中心點，共16組實驗，各因子及水平見表1，實驗設(shè)計及實驗結(jié)果見表2。當α-淀粉添加量為140 μL，葡糖淀粉酶添加量為80 μL，普魯蘭酶添加量為40 μL時，DE最高值為65.2。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平編碼表

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 方差分析

對實驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。模型顯著性檢驗P值為0.000 5(P<0.05為影響顯著)，失擬項為0.001 2(Lack of Fit>0.05為影響不顯著)，說明實驗得到的數(shù)據(jù)結(jié)果與模型吻合度較好，表明該模型具有統(tǒng)計學意義。α-淀粉酶、葡糖淀粉酶是影響糖化液DE值的主要因素，而普魯蘭酶是非主要因素。

表3 響應(yīng)面分析實驗的回歸模型分析結(jié)果

2.2.3 建立二次響應(yīng)面回歸模型

利用Design expert 10.0.4軟件進行數(shù)據(jù)處理，確定的回歸方程為：

DE值=50.8+6.65A+5.35B-0.1C+0.67AB-0.53AC-0.38BC+2.29A2-2.36B2-0.31C2

式中：A為α-淀粉酶編碼值；B為葡糖淀粉酶編碼值；C為普魯蘭酶編碼值。

回歸方程R2=0.972 9，CV=3.38%，表明方程擬合度好，失擬較小，可以用該方程代替真實實驗結(jié)果進行分析。

2.2.4 響應(yīng)因子水平優(yōu)化解決方案

由二次回歸方程得出的最優(yōu)酶配方組合為：α-淀粉酶添加量140 μL，葡糖淀粉酶添加量80 μL，普魯蘭酶添加量40 μL，預(yù)測糖化液DE值為64.1，實際測定糖化液DE值為65.2，擬合度為98.29%?？紤]到添加普魯蘭酶的成本較高，得到最終的酶配方為：α-淀粉酶140 μL、葡糖淀粉酶60 μL、普魯蘭酶20 μL。

2.2.5 最佳酶配方驗證

從表4可見，在最佳酶配方下制備的糖漿DE值為55.0，滿足設(shè)計要求。放大實驗與小試實驗糖組分相近?？砂l(fā)酵性糖比例滿足設(shè)計要求，但糖漿中的葡萄糖含量偏高。

表4 玉米淀粉制糖關(guān)鍵質(zhì)量指標對比

2.3 玉米淀粉水解制備糖漿新工藝中試放大實驗

按照1.3.2的制糖方法以及1.3.5.1的糖化方法以及1.3.5.2的發(fā)酵方法進行擴大實驗，跟蹤實驗過程關(guān)鍵參數(shù)，并分析冷麥汁及成品啤酒的理化指標，驗證制得的糖漿在啤酒釀造中的可行性。

2.3.1 中試放大實驗過程

2.3.1.1 中試實驗糖化過程關(guān)鍵控制參數(shù)

從表5可見，實驗麥汁制備工藝解決了玉米淀粉輔料生產(chǎn)高濃麥汁的過濾瓶頸，過濾時間110 min，殘?zhí)?.0 °P，浸出物收得率達到98.2%，滿足設(shè)計要求。按照制糖時間180 min計算，日糖化投料批次達到8批，效率可以達到與常規(guī)工藝相同。

表5 中試實驗糖化關(guān)鍵控制參數(shù)比較

2.3.1.2 中試實驗糖化關(guān)鍵質(zhì)量指標

從表6可見，采用實驗工藝制備的超高濃麥汁與常規(guī)工藝制備的14 °P麥汁在pH、濁度、總酸等指標上沒有明顯差別。麥汁極限發(fā)酵度相近，表明可發(fā)酵性糖含量無明顯差別。色度、α-氨基氮指標隨麥汁濃度增加而增大。均滿足工藝標準的要求。

表6 糖化冷麥汁指標

2.3.2 中試實驗啤酒理化指標及品評結(jié)果

中試實驗啤酒的理化指標如表7所示，5名國家級啤酒評委品評結(jié)果如圖3所示。從表7可見，主要理化指標，實驗啤酒與普通啤酒無明顯差異，滿足GB/T 4927—2008要求。由圖3可見，實驗啤酒與普通啤酒在外觀、香氣、醇酯等維度上無明顯差異，泡沫潔白細膩，酒體柔和協(xié)調(diào)，爽口，可飲性強，接受度100%。

表7 成品啤酒理化指標

圖3 感官品評結(jié)果

3 結(jié)論

使用α-淀粉酶、葡糖淀粉酶及普魯蘭酶三種酶制劑協(xié)同水解玉米淀粉制備糖漿的新工藝，單因素與響應(yīng)面實驗結(jié)果表明，α-淀粉酶及葡糖淀粉酶對糖化液DE值的影響最大。綜合考慮酶制劑成本后確定的酶制劑添加量為：α-淀粉酶140 μL，葡糖淀粉酶60 μL，普魯蘭酶20 μL，在此條件下，中試驗證實驗糖漿DE值達到55.0，滿足設(shè)計目標要求。開發(fā)的三段式水解工藝制糖時間縮短到3 h以內(nèi)，制糖效率的提升可以實現(xiàn)玉米淀粉在啤酒廠利用現(xiàn)有設(shè)備轉(zhuǎn)化為糖漿。使用50%玉米淀粉輔料制備18 °P超高濃麥汁的生產(chǎn)工藝經(jīng)釀酒實驗評估，可在啤酒廠工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，釀制的啤酒滿足國家標準的要求，日糖化投料批次達到8批，生產(chǎn)效率提高28%，同時進一步降低了能源消耗及成本，提高了經(jīng)濟效益。