孫飛龍，寧景葉，王鳳娟，原 龍，朱 琳

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048)

0 引 言

赤色葉球的紅菊苣也稱為結(jié)球紅菊苣和軟化白菊苣，是一種食藥同源的無(wú)公害蔬菜[1]，具有較高的抗氧化活性，有利尿消腫、清肝利膽、健胃解膩等功效[2-3]，可用于預(yù)防心血管疾病、癌癥和延緩衰老[4-6]。

花色素富含酚類物質(zhì)，具有保健功效和營(yíng)養(yǎng)作用，常用于食品著色、衣料染色、化妝品上色及醫(yī)藥等方面[7-9]?；ㄉ卦诩t菊苣中含量豐富，經(jīng)粗提物提取獲得的花色素含有較多的小粉、果膠、卵白和易分解的糖等雜物，影響并限制了花色素的質(zhì)地和純度[10-12]。為了提煉優(yōu)質(zhì)和雜物少的花色素，提高紅菊苣花色素的產(chǎn)量和質(zhì)量，需對(duì)粗提物進(jìn)行提純。多孔微球吸附因工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、分離效率高、不和糖類相互作用、洗脫容易等優(yōu)點(diǎn)在花色素的眾多純化方法中脫穎而出[13-15]。本文采用動(dòng)靜態(tài)吸附及解析實(shí)驗(yàn)分析多孔微球法純化紅菊苣花色素的最佳工藝，并采用高效液相色譜分析其組成,探究多孔微球?qū)t菊苣花色素的提純效果。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 新鮮紅菊苣(市場(chǎng)所售)；8種型號(hào)多孔微球(AB-8、D-280、HPD300、HPD600、X-5、D101、D3520)、聚酰胺(源辰化工材料有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)品(矢車菊-3-O-葡萄糖苷，成都曼斯特生物科技有限公司)；氫氧化鈉(NaOH,四川西隴試劑有限公司)；鹽酸(HCl,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鉀(K2HPO4，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸(CA，西安百盛化工有限公司)；丙酮(C3H6O,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇(C2H6O,天津廣成化學(xué)試劑有限公司)；氯化鉀(KCl，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(H3PO4，天津恒興化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(CH3OH,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；以上試劑均為分析純，無(wú)菌水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 儀器 超聲波清洗機(jī)(SK5200LHC，超聲儀表上?？茖?dǎo)有限公司)；電熱恒溫水箱(W13-40，天津泰斯特器械有限公司)；真空干燥箱(DJ-IBC，天津泰斯特器械有限公司)；分光光度計(jì)(可見(jiàn)光722，上海精密科學(xué)儀表有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(DGF-1AB立式，天津泰斯特儀器有限公司)；電子天平(托利多-梅特勒儀器有限公司)；水式循環(huán)真空泵(SHA-D，鞏義英裕予華儀表廠)；精密酸度計(jì)(pH-3C，上海雷磁儀器廠)；渦旋混合儀(XW-80A，上海滬西分析儀器廠)；液相色譜儀(Agilent1200，美國(guó)Agilent公司)。

1.2 紅菊苣花色素純化工藝

1.2.1 制備粗提液 使用無(wú)菌水清洗紅菊苣，切成小塊，在60 ℃電熱鼓風(fēng)環(huán)境下干燥24 h后破碎，經(jīng)80目篩過(guò)濾。稱取紅菊苣粉末4 g，與體積分?jǐn)?shù)為70% 的酸性乙醇(含0.1%鹽酸)在41 mL∶1 g的液固比條件下混勻，在40 kHz、200 W避光條件下超聲提取28 min，經(jīng)減壓過(guò)濾、濃縮得到粗提花色素液體，置于5 ℃冰箱中備用。

1.2.2 預(yù)處理多孔微球脂 在體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇的液體中浸入多孔微球24 h，當(dāng)樹(shù)脂脹大，排空微球中的空氣，用無(wú)菌水將其反復(fù)沖至無(wú)異味；再浸入體積分?jǐn)?shù)為5%的HCl溶液中12 h，用流動(dòng)的無(wú)菌水進(jìn)行清洗；最后在體積分?jǐn)?shù)為5%NaOH液體中浸入12 h，浸畢，用無(wú)菌水清洗并調(diào)節(jié)pH為7，多孔微球中殘存的單體化合物和防腐物質(zhì)經(jīng)過(guò)上述步驟可去掉[16]。

1.2.3 篩選最佳多孔微球 真空過(guò)濾多孔微球，在250 mL的燒杯中分別放入8種4 g多孔微球，再加入100 mL質(zhì)量濃度為110.89 mg/mL，pH=2.76未提純的花色素液體。在恒溫振蕩器中放入配置好的溶液，在溫度25 ℃，速度120 r/min的條件下振蕩24 h。浸泡完全后，進(jìn)行抽濾，用pH示差法計(jì)算濾液中所含花色素[17]的吸附率。

8種多孔微球經(jīng)過(guò)真空過(guò)濾，分別放4 g于250 mL燒杯中，加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，振蕩24 h，抽濾，測(cè)定花色素在濾液中的含量，計(jì)算解吸程度[18]。

多孔微球的反應(yīng)效率：

(1)

(2)

式中：C0為處理前樣液中紅菊苣花色素質(zhì)量濃度,mg/mL；C1為處理后濾液中紅菊苣花色素質(zhì)量濃度,mg/mL；C2為濾液解吸后紅菊苣花色素質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.2.4 AB-8多孔微球靜態(tài)實(shí)驗(yàn) 在150 mL定量瓶中放入8份2 g經(jīng)前處理的多孔微球，加入50 mL質(zhì)量濃度為110.89 mg/mL的粗提取液，在恒溫振蕩器中放入配置好的溶液，在溫度25 ℃，速度120 r/min的條件下振蕩24 h，每隔0.5 h進(jìn)行1次抽濾，測(cè)得溶液中所含花色素的量。

在150 mL容量瓶中放入6份2 g處理后的樹(shù)脂，設(shè)置好添加樣液的pH值梯度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)，在恒溫振蕩器中放入配置好的溶液，在溫度25 ℃、速度120 r/min條件下振蕩24 h，待其充分吸入后，再進(jìn)行抽濾，測(cè)得花青素溶解在濾液中的量，計(jì)算吸附率。

1.2.5 AB-8多孔微球動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn) 1) 濃度影響。濕法向柱內(nèi)裝入4 g AB-8型多孔微球，分別配制100 mL質(zhì)量濃度分別為64.87、108.29、153.79、197.21、249.76、304.08、341.33、378.88、432.34 mg/L未提純的樣液，流過(guò)柱內(nèi)速度為2 mL/min，測(cè)定流出液中所含花色素的量。

2) 流速影響。濕法向柱內(nèi)裝入4 g AB-8型多孔微球，添加200 mL的未提純樣液，速度梯度分別為1、2、3 mL/min，測(cè)出流出液中所含花色素的量并計(jì)算吸附率。

3) 流出液體積。濕法向柱內(nèi)裝入4 g AB-8型多孔微球，在柱內(nèi)以2 mL/min的速度加入吸光值A(chǔ)=1.654的花色素粗提取液，每隔20 min測(cè)量獲得液的吸光度值A(chǔ)+，A+=A/10開(kāi)始記錄[19]，取5次數(shù)據(jù)求平均數(shù)，得到AB-8多孔微球?qū)ㄇ嗨貏?dòng)態(tài)吸附泄露曲線。

4) 乙醇解吸。濕法向柱內(nèi)裝入AB-8型多孔微球，用無(wú)菌水清理，再以2 mL/min的流速對(duì)100 mL不同體積分?jǐn)?shù)(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇進(jìn)行清洗，測(cè)得洗脫液所含花色素的量并計(jì)算樹(shù)脂解吸效率。

5) 洗脫影響。濕法在柱內(nèi)裝入AB-8型多孔微球，先用無(wú)菌水清洗，再用速度為2 mL/min乙醇(60%)進(jìn)行洗脫，每收集10 mL解吸液測(cè)定吸光值1次，當(dāng)解吸液吸光值不變時(shí)，停止上樣。

1.2.6 純化后色價(jià)測(cè)定 依照GB 6718—86測(cè)定紅菊苣中花色素色價(jià)，稱取1 g提純后的花色素細(xì)粉，用pH=3.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖劑稀釋100倍。在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，保證吸光值在0.2～0.6之間，取5次數(shù)據(jù)求平均數(shù)?；ㄇ嗨厣珒r(jià)計(jì)算公式[20]為

(3)

1.3 紅菊苣花色素組分

1.3.1 溶液配置及處理 流動(dòng)相A：過(guò)濾甲醇采用0.45 μm微孔濾膜，超聲至無(wú)氣泡。流動(dòng)相B：磷酸-蒸餾水體積比為0.3∶99.7；進(jìn)樣液。用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾紅菊苣的花色素提純液[21]。

1.3.2 色譜條件及程序洗脫步驟 采用高效液相色譜法(HPLC)分析紅菊苣所含花色素的成分，采用程序洗脫法在0～35 min內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)為25%的流動(dòng)相A進(jìn)行洗脫；在30～50 min內(nèi)，用體積分?jǐn)?shù)為75%的流動(dòng)相A進(jìn)行洗脫；洗脫液體積為10 μL，洗脫流速1 mL/min，將520 nm的波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，設(shè)置柱溫為40 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定多孔微球類型

在花色素中存在多個(gè)酚類基團(tuán)，易與多孔微球中的原子團(tuán)形成次級(jí)鍵，因此花色素在極性多孔微球中得到的吸收效果較好，但多孔微球表面積也會(huì)影響花色素的吸附效果?；ㄉ刈陨淼慕Y(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的極性與親水性，也可選用弱極性的多孔微球。多孔微球篩選結(jié)果如圖1所示。

圖1 多孔微球的篩選Fig.1 Selection of porous microsphere

從圖1可以看出，AB-8型多孔微球的吸附效率最高，解吸效率與D280型多孔微球差距較小，因此AB-8型多孔微球?yàn)樽罴盐轿⑶?，在處理過(guò)程中多孔微球中的原子團(tuán)易與花色素形成次級(jí)鍵。

2.2 AB-8型多孔微球靜態(tài)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 確定靜態(tài)吸附/解吸平衡時(shí)間 靜態(tài)吸附/解吸動(dòng)力曲線如圖2所示。

圖2 靜態(tài)吸附/解吸動(dòng)力曲線圖Fig.2 Kinetic curve of static adsorption/desorption

從圖2可以看出，吸附率在0.5～1.0 h之間出現(xiàn)較大的波動(dòng)，吸附率在2.5 h后趨于穩(wěn)定，多孔微球處于飽和吸附狀態(tài)，因此2.5 h被視作靜態(tài)的吸附時(shí)間。隨時(shí)間的增加解吸率也增加，1.5 h后達(dá)到穩(wěn)定，大都在多孔微球中吸附的花色素可以被解吸下來(lái)，所以選擇1.5 h作為靜態(tài)解吸時(shí)間。

2.2.2 上樣液pH對(duì)多孔微球吸附效率的影響 上樣液pH對(duì)多孔微球吸附效率的影響如圖3所示。

圖3 上樣液pH對(duì)多孔微球吸附率的影響Fig.3 Effect of pH of sample solution on adsorption rate of porous microsphere

從圖3可以看出，在pH=1～2區(qū)間內(nèi)，多孔微球?qū)ι蠘右旱淖饔弥饾u平穩(wěn)；但當(dāng)pH>2，尤其是在2～3之間時(shí)，作用效率迅速下降，因?yàn)榧t菊苣花色素在較強(qiáng)酸性條件下，主要以陽(yáng)離子的形式存在，易與弱極性的多孔微球相聯(lián)結(jié)，伴隨酸性的削減，花色素的存在形式在結(jié)構(gòu)比例上發(fā)生變化，干擾花色素與多孔微球的聯(lián)結(jié)，故選用pH=2的樣液。

2.3 AB-8型多孔微球動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)多孔微球作用的影響 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)多孔微球吸附率的影響如圖4所示。

圖4 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)多孔微球吸附率的影響Fig.4 Effect of concentration of sample solution on adsorption rate of porous microsphere

從圖4可以看出，在紅菊苣花色素的質(zhì)量濃度不斷增加過(guò)程中，多孔微球的作用效果在304.08 mg/L之前平穩(wěn)上升并在341.33 mg/L達(dá)到最高，隨后開(kāi)始減弱。因此太低的花色素含量減弱了多孔微球的作用；太高的花色素含量，使多孔微球吸收無(wú)用的雜物，從而干擾花色素流過(guò)多孔微球中的速度，導(dǎo)致上樣液過(guò)早泄露，減弱了多孔微球的作用效果，因此選擇質(zhì)量濃度為341.33 mg/L的樣液最佳。

2.3.2 上樣液流速對(duì)多孔微球吸附率的影響 隨著上樣液流過(guò)柱內(nèi)的速度下降，花色素和多孔微球的交匯時(shí)間延遲，效果顯著但導(dǎo)致效率衰減，實(shí)驗(yàn)周期更長(zhǎng)；增大速度會(huì)縮短樣液和多孔微球的接觸時(shí)間，效果越差；上樣流速對(duì)多孔微球吸附率的影響如圖5所示。

圖5 上樣液流速對(duì)多孔微球吸附率的影響Fig.5 Effect of flow rate of sample solution on adsorption rate of porous microsphere

從圖5可以看出，隨著流出液體積的不斷增加，吸附率不斷下降，并且上樣液的速率越小，吸附率下降越慢，因此越小的上樣液流速吸附效果越好，最佳上樣液流速為2 mL/min。

2.3.3 花青素泄露曲線測(cè)定 AB-8多孔微球?qū)ㄇ嗨貏?dòng)態(tài)吸附泄漏曲線如圖6所示。

圖6 AB-8多孔微球?qū)ㄇ嗨貏?dòng)態(tài)吸附泄漏曲線Fig.6 Dynamic adsorption-leakage curve of AB-8 porous microsphere for anthocyanins

從圖6可以看出，隨著流出液體積的增多，流出液的吸光度也呈遞增趨勢(shì)，在流出液體積為260 mL時(shí)，吸光度達(dá)到0.169，視作泄漏點(diǎn)，所以上樣量為260 mL。

2.3.4 乙醇濃度對(duì)多孔微球解吸的影響 實(shí)際上，解吸過(guò)程是用一種解吸液使花色素和多孔微球之間的相互作用力減弱。從AB-8微球中分離出花色素，但乙醇溶液濃度不同極性有差別，不同程度地干擾了相互作用力的效果。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多孔微球解吸的影響見(jiàn)表1。

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多孔微球解吸的影響Tab.1 Effect of ethanol volume fraction on desorption of porous microsphere

從表1可看出，解吸率在乙醇溶液濃度較低時(shí)效果較差，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)效果最好，之后解吸效果開(kāi)始下降。所以在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，最大解吸率為91.45%，因此將體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液作為解吸液。

2.3.5 洗脫曲線測(cè)定 紅菊苣花色素洗脫曲線如圖7所示。

圖7 紅菊苣花色素的洗脫曲線Fig.7 Elution curves of anthocyanidins of chicory red

從圖7可以看出，AB-8型多孔微球的洗脫峰較窄，大部分附著在多孔微球上的紅菊苣花色素?zé)o需用大量解吸液就被解吸。當(dāng)洗脫劑用量為100 mL時(shí)，附著于多孔微球上的花色素幾乎全部被解吸，所以選擇100 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇作為洗脫液。

2.4 紅菊苣花色素定性分析

在最優(yōu)條件下，選擇AB-8型多孔微球進(jìn)行提純，測(cè)定紅菊苣花色素色價(jià)從5.3提升至49.1，是未純化的9.3倍。從顏色判斷,提純后紅菊苣的花色素液體表現(xiàn)為血色樣，由花色素的種類與顏色進(jìn)行推斷，紅菊苣所含的花色素為矢車菊類的花色素。進(jìn)行HPLC測(cè)定后，標(biāo)準(zhǔn)矢車菊-3-O-葡萄糖苷與紅菊苣的供試樣品色譜圖對(duì)照如圖8所示。

從圖8(a)可以看出，標(biāo)準(zhǔn)矢車菊-3-O-葡萄糖苷的出峰時(shí)刻為13.539 min；從圖8(b)可以看出，紅菊苣液體共含6種花色素，花色素的出峰時(shí)刻為13.609 min，接近于標(biāo)準(zhǔn)矢車菊-3-O-葡萄糖苷的出峰時(shí)刻，可以斷定紅菊苣中的花色素以矢車菊-3-O-葡萄糖苷為主。

(a) 矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)品色譜圖

3 結(jié) 論

1) 采用8種多孔微球?qū)Υ痔岬募t菊苣花色素液體進(jìn)行純化。結(jié)果表明，AB-8多孔微球?yàn)樽顑?yōu)提純多孔微球。

2) 用AB-8多孔微球?qū)ㄉ剡M(jìn)行提純，根據(jù)多孔微球的動(dòng)、靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出AB-8多孔微球提純的最佳工藝條件，可將花色素的色價(jià)從5.3升到49.1，達(dá)到未純化的9.3倍。

3) 采用HPLC分析紅菊苣花色素的組成成分，結(jié)果顯示紅菊苣含有6種花色素，其中矢車菊-3-O-葡萄糖苷含量豐富。