郭 平， 常菁華， 王劍飚

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院藥劑科，上海 200025）

瘧疾是一種由瘧原蟲(chóng)感染引起的寄生蟲(chóng)病。人體感染瘧原蟲(chóng)后初期癥狀往往不典型，可出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、胃腸道不適和肌肉酸痛等癥狀，類似病毒感染；重癥患者可出現(xiàn)黃疸、意識(shí)模糊、癲癇等癥狀。多數(shù)患者及時(shí)治療后癥狀可迅速消退，但未及時(shí)接受救治者可能因腦型瘧疾、瘧疾性貧血等嚴(yán)重并發(fā)癥導(dǎo)致昏迷，甚至死亡[1]。中性粒細(xì)胞和/或單核細(xì)胞中的綠色包涵體是一類在外周血涂片中罕見(jiàn)的白細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，既往報(bào)道主要見(jiàn)于急性肝衰竭[2]、乳酸中毒[3]或新型冠狀病毒肺炎重癥患者[4]。人體發(fā)生惡性瘧原蟲(chóng)感染后，白細(xì)胞中出現(xiàn)綠色包涵體和瘧色素的病例尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在回顧分析1例外周血白細(xì)胞綠色包涵體合并瘧色素病例的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和相應(yīng)臨床癥狀，以加深廣大醫(yī)務(wù)工作者對(duì)該類病例的認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 病例基本情況

患者，男，53歲。因高熱伴關(guān)節(jié)酸痛于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診，熱峰39.2 ℃。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院先后以靜滴頭孢吡肟+口服奧司他韋治療，未見(jiàn)明顯好轉(zhuǎn)，遂至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院就診?；颊叻猛藷崴幬锖篌w溫可降至正常，但次日均出現(xiàn)反復(fù)。住院期間患者出現(xiàn)意識(shí)不清、呼吸急促、大小便失禁等癥狀。追問(wèn)病史得知，患者2019年10月26—30日至尼日利亞出差，是否有蚊蟲(chóng)叮咬史不詳。既往史：高血壓10年，血壓控制良好；1988年患甲型肝炎；2009年髕骨骨折，行手術(shù)；2010年股骨骨折，行手術(shù)；否認(rèn)結(jié)核等其他傳染病史。查體：精神一般，體溫>37.0 ℃，脈搏139次/min，皮膚鞏膜黃染。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查提示惡性瘧原蟲(chóng)感染，收治于重癥監(jiān)護(hù)病房，予以青蒿琥酯抗瘧疾，輔以其他相應(yīng)治療。治療期間患者病情曾現(xiàn)好轉(zhuǎn)，意識(shí)恢復(fù)，但某日突然加重，體溫再次升高，外周血CD3、CD4、CD8絕對(duì)計(jì)數(shù)顯著下降，提示免疫功能嚴(yán)重受損。后因多臟器衰竭、感染性休克、重癥肺炎、重癥免疫缺陷、混合型酸堿失調(diào)、電解質(zhì)紊亂等并發(fā)癥，雖經(jīng)全力救治，仍不幸離世。

1.2 研究方法

（1）樣本采集。采集患者入院時(shí)乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈全血2 mL、肝素抗凝全血4 mL，立即送檢；治療期間每日采集乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈全血2 mL，立即送檢。（2）血常規(guī)和C反應(yīng)蛋白檢測(cè)。檢測(cè)前執(zhí)行每日質(zhì)控，質(zhì)控通過(guò)后，采用全血細(xì)胞計(jì)數(shù)+C反應(yīng)蛋白模式檢測(cè)，記錄結(jié)果。（3）生化項(xiàng)目檢測(cè)。檢測(cè)前執(zhí)行每日質(zhì)控，將肝素抗凝全血樣本以1 676×g離心5 min，取上清，進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果。（4）免疫膠體金瘧原蟲(chóng)抗原檢測(cè)。將5 μL乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈全血置于膠體金板條小孔中，滴加裂解液2滴，靜置15 min后觀察結(jié)果。（5）瘧原蟲(chóng)厚、薄血膜制作。厚血膜：取外周血2滴黏附于載玻片上，涂成直徑約1 cm的厚薄均勻的血膜，室溫干燥；薄血膜：取外周血l滴黏附于載玻片上，推制成薄片，干燥后以甲醇固定薄血膜。取吉姆薩染色液A液與B液，以1∶9的比例配置染液，混勻后染色30 min，流水沖凈染液，干燥后鏡檢。（6）油紅O染色。油紅O儲(chǔ)備液與蒸餾水以3∶2比例配置為油紅O染色液，靜置15 min。吸取油紅O染色液上層染色10 min，流水沖洗30 s，蘇木精染液染色2 min，流水沖洗5 min，干燥后鏡檢。

1.3 儀器和試劑

BC5390 CRP血液分析儀及配套試劑（深圳邁瑞公司）；AU5800全自動(dòng)生化分析儀和總膽紅素、直接膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、白蛋白、尿素、肌酐檢測(cè)試劑盒（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；免疫膠體金瘧原蟲(chóng)抗原檢測(cè)（上海市臨床檢驗(yàn)中心）；吉姆薩染液、油紅O染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

患者于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院入院時(shí)血常規(guī)和生化檢查結(jié)果顯示，血小板計(jì)數(shù)為12×109/L（嚴(yán)重減少），中性粒細(xì)胞百分比為82.7%（升高），C反應(yīng)蛋白>200 mg/L（升高），總膽紅素71.3 μmol/L（明顯升高）、直接膽紅素24.8 μmol/L（升高），肝、腎功能異常，見(jiàn)表1。免疫膠體金抗原檢測(cè)提示惡性瘧感染。

表1 患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

2.2 外周血涂片鏡檢結(jié)果

患者入院時(shí)外周血涂片可見(jiàn)瘧原蟲(chóng)環(huán)狀體[圖1（a）、圖1（b）]，蟲(chóng)體密度高。治療期間瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)體密度逐漸下降，但至治療后期仍未完全消失，外周血、腦脊液涂片均可見(jiàn)蟲(chóng)體殘留（圖2）?；颊卟∏閻夯笸庵苎科行粤＜?xì)胞出現(xiàn)中毒顆粒，在約16%的中性粒細(xì)胞和少數(shù)單核中觀察到綠色包涵體和瘧色素[圖1（c）、圖1（d）]。胞質(zhì)中包涵體呈藍(lán)綠色，數(shù)量不一、大小不等、形態(tài)不規(guī)則，具有一定折射性。油紅O染色后包涵體呈橘紅色，瘧色素未染色，提示包涵體油紅O染色陽(yáng)性、瘧色素陰性（圖3）。

圖1 患者入院時(shí)外周血涂片鏡檢結(jié)果（×1 000）

圖2 患者治療后期外周血和腦脊液涂片（×1 000）

圖3 患者外周血涂片油紅O染色結(jié)果

3 討論

綠色包涵體是2009年Harris等在肝病患者外周血中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的類脂褐素物質(zhì)[5]。目前為數(shù)不多的報(bào)道顯示其僅在急性肝衰竭、乳酸酸中毒、產(chǎn)氣莢膜梭菌或大腸埃希菌相關(guān)敗血癥、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒感染患者中被發(fā)現(xiàn)[6]。綠色包涵體的出現(xiàn)與疾病的不良預(yù)后密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有56%～72%的出現(xiàn)綠色包涵體的肝病患者在氨基轉(zhuǎn)移酶急劇升高后病情迅速惡化，并在短時(shí)間內(nèi)死亡，這個(gè)過(guò)程僅2～14 d[7-8]。本例患者因在非洲感染惡性瘧原蟲(chóng)起病，回國(guó)后輾轉(zhuǎn)多時(shí)未明確病因，引起原蟲(chóng)大量繁殖，轉(zhuǎn)至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院時(shí)已進(jìn)展為極為兇險(xiǎn)的腦型瘧疾，外周血涂片可見(jiàn)大量惡性瘧原蟲(chóng)環(huán)狀體。治療期間患者情況曾有好轉(zhuǎn)，臨床表現(xiàn)向好，意識(shí)逐漸恢復(fù)。但對(duì)外周血涂片的連續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同階段的蟲(chóng)體仍有殘留，甚至在治療后期，患者的腦脊液中依然存在蟲(chóng)體，患者在病情急轉(zhuǎn)直下前免疫功能嚴(yán)重受損。因此，我們推測(cè)，持續(xù)的原蟲(chóng)血癥導(dǎo)致免疫功能嚴(yán)重受損可能是患者后期病情突然加重的原因之一。

患者病情加重后，外周血涂片可見(jiàn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中出現(xiàn)藍(lán)綠色包涵體和瘧色素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，出現(xiàn)包涵體的細(xì)胞約占所有中性粒細(xì)胞的1%～10%[8]，并伴隨胞質(zhì)空泡、顆粒增多以及杜勒小體等中性粒細(xì)胞中毒改變，這與我們觀察到的情況類似。HARRIS等[5]認(rèn)為，綠色包涵體本質(zhì)上可能與膽綠素相關(guān)，但是目前沒(méi)有針對(duì)膽綠素的染色方法來(lái)證實(shí)這一點(diǎn)。分析包涵體的結(jié)構(gòu)后，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞綠色包涵體的光學(xué)顯微鏡鏡下外觀、富脂性和耐酸性與蠟樣脂褐素一致，電子顯微鏡鏡下外觀與神經(jīng)元脂褐素的報(bào)告相似[9]。脂褐素主要由被溶酶體消化的含脂殘留物組成，其中還包括蛋白質(zhì)、碳水化合物和微量元素[10-11]。當(dāng)肝臟因缺氧受損時(shí)，脂褐素從壞死的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中被釋放出來(lái)[12]，所以綠色包涵體可能是一種脂褐素樣物質(zhì)，或類似的溶酶體降解產(chǎn)物，在肝臟和其他器官因缺血受損后被細(xì)胞吞噬。由于這類物質(zhì)具有親脂性，因此使用油紅O染色結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性[8]。通過(guò)油紅O染色，我們發(fā)現(xiàn)包涵體確為陽(yáng)性，而黃褐色結(jié)晶狀物質(zhì)染色陰性。結(jié)合患者疾病背景及結(jié)晶狀物質(zhì)形態(tài)，提示該物質(zhì)為中性粒細(xì)胞吞噬的瘧色素。瘧色素是瘧原蟲(chóng)分解代謝血紅蛋白的最終產(chǎn)物，隨著蟲(chóng)體在紅細(xì)胞中裂體的增殖，瘧色素逐漸融合，最后隨破裂紅細(xì)胞進(jìn)入血液，并被中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞吞噬。外周血吞噬細(xì)胞中能否觀察到瘧色素與瘧疾的嚴(yán)重程度相關(guān)，而大量含瘧色素中性粒細(xì)胞的出現(xiàn)同樣提示預(yù)后不良[13]。目前，臨床對(duì)于這類異常的報(bào)道相對(duì)較少，主要原因可能有以下3點(diǎn)：（1）發(fā)生率低，易漏檢；（2）忽視了該包涵體的折光性，容易誤認(rèn)為是杜勒小體；（3）缺乏認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)但未報(bào)告。

外周血涂片中形態(tài)學(xué)異常對(duì)疾病的臨床判斷及預(yù)后至關(guān)重要。我們對(duì)這例腦型瘧疾患者在診療過(guò)程中出現(xiàn)在外周血白細(xì)胞中的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行跟蹤觀察，發(fā)現(xiàn)綠色包涵體和瘧色素的出現(xiàn)對(duì)重癥瘧疾預(yù)后不佳患者病情的發(fā)展具有重要提示作用。希望通過(guò)對(duì)該病例的報(bào)道和分析，加深廣大實(shí)驗(yàn)室工作人員和臨床醫(yī)務(wù)人員對(duì)這一現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)，避免漏檢的發(fā)生，以及時(shí)進(jìn)行救治，盡量避免患者死亡。