何智軍 何偉 洪志楠 李子褀 魏秋實(shí) 陳曉俊 顏新昊

臨床上股骨頭壞死(Osteonecrosis of Femoral Head，ONFH)與過(guò)度使用皮質(zhì)類固醇密切相關(guān)，導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡和股骨頭結(jié)構(gòu)完整性喪失，并破壞骨血管組織[1-2]。壓電通道蛋白1(Piezoelectric channel protein 1，Piezo1)是骨骼發(fā)育和成骨細(xì)胞分化所需的關(guān)鍵生物力傳感器之一，其功能的發(fā)揮與Yes相關(guān)蛋白1(Yes associated protein 1，Yap1)密切相關(guān)[3]。Piezo1缺失可抑制成骨細(xì)胞分化，還改善在發(fā)育過(guò)程中的骨骼損失，因?yàn)镻iezo1激活可誘導(dǎo)Yap1和轉(zhuǎn)錄因子β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的表達(dá)并活化Yap1/β-catenin信號(hào)[4]。然而，Piezo1在皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)ONFH中的表達(dá)情況及對(duì)骨細(xì)胞凋亡和血管生成的調(diào)節(jié)作用并不明確。

本研究通過(guò)類固醇誘導(dǎo)ONFH動(dòng)物模型，研究沉默Piezo1對(duì)ONFH發(fā)生的影響并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組處理

48只成年雄性Wistar大鼠(12周齡)購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 每只動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為55 cm×35 cm×26 cm的有機(jī)玻璃籠子中，光照/黑暗周期12 h/12 h，溫度24～25 ℃，濕度50%～55%。動(dòng)物自由采食飲水。所有實(shí)驗(yàn)方案均遵守美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院出版的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》，并經(jīng)本院動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

經(jīng)過(guò)完全隨機(jī)法將所有大鼠分為4組，各12只。1)類固醇激素+siP1組(STE+siP1組)：在第1天用1.5 mL注射器于大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨富集處垂直骨面進(jìn)針，髓腔注射siP1的體內(nèi)轉(zhuǎn)染復(fù)合物 50 μL，注射完2 h后和24 h后靜脈注射1.8 mg/kg的LPS，并于第3，4，5，6，7天肌肉注射25 mg/kg甲基強(qiáng)的松龍，以促進(jìn)股骨頭壞死的發(fā)展，在第15天再次髓腔注射50 μL siP1體內(nèi)轉(zhuǎn)染復(fù)合物。2)類固醇激素+siNC組(STE+siNC組)：將髓腔注射的siP1替換為等量的siNC的體內(nèi)轉(zhuǎn)染復(fù)合物，其余步驟和1)一致。3)類固醇激素組(STE組)：在第1天用1.5 mL注射器于大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨富集處垂直骨面進(jìn)針，髓腔注射生理鹽水50 μL，注射完2 h后和24 h后靜脈注射1.8 mg/kg的LPS，并于第3，4，5，6，7天肌肉注射25 mg/kg甲基強(qiáng)的松龍，以促進(jìn)股骨頭壞死的發(fā)展，在第15天再次髓腔注射50 μL生理鹽水。4)對(duì)照組，與1)相同模式相同時(shí)間點(diǎn)，用0.9%生理鹽水替代siPiezo1、LPS、甲潑尼龍。最后一次注射甲基強(qiáng)的松龍21 d后，斷頸法處死動(dòng)物。每組隨機(jī)收集6只股骨頭骨新鮮組織用于表達(dá)檢測(cè)及制作切片。

在4%低聚甲醛-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中固定24 h后，用10%乙二胺四乙酸-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)將股骨脫鈣5周。脫鈣后，將組織在梯度乙醇中脫水，包埋在石蠟中，沿冠狀平面切成4 μm厚的切片。

1.2 試劑與耗材

Piezo1 siRNA(siPiezo1，siP1)和siRNA陰性對(duì)照(siNC)購(gòu)于上海Genechem公司。甲基強(qiáng)的松龍購(gòu)于大連輝瑞制藥。杜氏改良培養(yǎng)液(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)/F-12、青霉素、鏈霉素均購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司。人成骨細(xì)胞系(hFOB1.19)和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC)購(gòu)于武漢普諾賽生物科技有限公司。重組人YAP1蛋白(Rh-YAP1)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。β-catenin激活劑(ICG-001)購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress公司。PrimeScript RT試劑盒購(gòu)于大連TaKaRa公司。PCR儀購(gòu)于北京Eastwin生命科學(xué)公司。SYBR Green酶購(gòu)于深圳富酶泰斯有限公司。Eco Real-Time PCR 系統(tǒng)購(gòu)于上海Illumina公司。裂解緩沖液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所。兔抗VEGFR2、CD3、Yap1、β-catenin抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。末端標(biāo)記(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling，TUNEL)試劑購(gòu)于南京凱基生物技術(shù)公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

人成骨細(xì)胞系hFOB1.19和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC)均培養(yǎng)于DMEM/F-12培養(yǎng)基(20%的BSA、50 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素)。分別使用1.0 μmol/L重組人YAP1蛋白(Rh-YAP1)及2.5 μmol/L的β-catenin激活劑(ICG-001)處理hFOB1.19細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞 24 h。收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 方法

1.4.1TUNEL分析 通過(guò)TUNEL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)股骨頭組織及所培養(yǎng)hFOB 1.19細(xì)胞的凋亡。骨組織中具有棕色核的細(xì)胞被評(píng)估為陽(yáng)性。對(duì)hFOB 1.19細(xì)胞則統(tǒng)計(jì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核的數(shù)量和總細(xì)胞核數(shù)。每組隨機(jī)選擇五個(gè)高倍視野(×200)來(lái)評(píng)估凋亡細(xì)胞的百分比(凋亡率)。

1.4.2實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR) 用Trizol試劑從大鼠的股骨頭中提取總RNA，檢測(cè)260 nm(A260)的吸光度來(lái)定量RNA的濃度，通過(guò)確定A260/A280比例評(píng)估RNA的純度。提取的總RNA(0.84 μg)用PrimeScript RT試劑盒在PCR儀上反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)條件：16 ℃ 0.5 h，41 ℃ 0.5 h，85 ℃ 5 min，4 ℃循環(huán))，cDNA在4 ℃下保存。在PCR擴(kuò)增之前，將cDNA保持在-20 ℃。qPCR反應(yīng)在20 μL含有引物和SYBR Green酶反應(yīng)體系的48孔光學(xué)PCR板中進(jìn)行，條件為在94 ℃下預(yù)變性4 min，然后在94 ℃下再次變性45個(gè)循環(huán)，在60 ℃下退火2 min，并在75 ℃下延伸1 min。目標(biāo)基因和內(nèi)參基因GAPDH同板擴(kuò)增，計(jì)算CT值，并使用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并且重復(fù)3次。實(shí)時(shí)定量PCR引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.4.3蛋白質(zhì)免疫印跡 組織樣本：將股骨頭磨成粉狀，在冷的含苯基甲基磺酰氟的RIPA裂解緩沖液中勻漿。細(xì)胞樣本：收集2組的HUVEC細(xì)胞，經(jīng)過(guò)超聲裂解。以上樣品經(jīng)過(guò)與上樣緩沖液混合，沸水浴中煮5 min，然后在-20 ℃下保存直至用于電泳。用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore Corporation，Bedford，馬薩諸塞州，美國(guó))上。用5%脫脂奶粉封閉2 h后，將膜與兔抗Piezo1(1∶500)、血管生成標(biāo)志物VEGFR2(1∶600)、CD3(1∶800)和Yap1(1∶800)、β-catenin(1∶600)蛋白第一抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜，而在25 ℃下與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶50 000，武漢博斯特生物技術(shù)有限公司) 孵育2 h。使用Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光底物(Thermo Fisher Scientific Inc.，馬薩諸塞州，美國(guó))對(duì)膜上的蛋白進(jìn)行顯色，通過(guò)Geliance 200 Imaging System進(jìn)行拍照。使用Image J軟件分析條帶灰度值。GAPDH作為的內(nèi)參蛋白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn) 將HUVEC細(xì)胞使用1.0 μmol/L Rh-YAP1及2.5 μmol/L的ICG-001處理24 h，并以5×103/孔的密度接種在Matrigel包被的12 孔板中，在37 ℃條件下孵育。16 h后，每孔拍攝5張照片。使用Image J軟件測(cè)量細(xì)胞形成的總小管長(zhǎng)度，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)復(fù)孔。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 股骨頭壞死大鼠模型

Micro-CT和HE染色可見STE組軟骨較薄，軟骨表面粗糙不平，部分脫落，骨細(xì)胞和骨基質(zhì)大量減少或丟失，皮質(zhì)骨和骨小梁內(nèi)出現(xiàn)壞死的細(xì)胞集落和大量空腔，對(duì)照(Control)組無(wú)上述特征(見圖1)。

圖1 STE誘導(dǎo)大鼠ONFH模型的建立

2.2 沉默股骨頭壞死大鼠體內(nèi)的Piezo1

與對(duì)照(Control)組比，STE組股骨頭骨組織中的Piezo1的mRNA水平以及蛋白水平在3，6，12，24 h都上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。另外，與STE+siNC組比，STE+siP1組Piezo1的mRNA水平以及蛋白水平在3，6，12，24 h下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 Piezo1在股骨頭壞死大鼠中的表達(dá)

2.3 Piezo1對(duì)股骨頭壞死大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響

最后一次注射甲基強(qiáng)的松龍21 d后，對(duì)照組中TUNEL凋亡率為5.2%，而STE組凋亡率為90.3%(P<0.01)。與STE+siNC組的凋亡率(89.5%)比，STE+siP1組的凋亡率(37.9%)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 Piezo1沉默對(duì) ONFH大鼠股骨頭組織凋亡的影響 (×200)

與對(duì)照組比，STE組Bax和Caspase-3的mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與STE+siNC組比，STE+siP1組Bax和Caspase-3的mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

圖4 Piezo1沉默對(duì)ONFH大鼠中凋亡標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)量的影響

2.4 微血管形態(tài)變化結(jié)果分析

與對(duì)照組比，STE組的股骨頭內(nèi)血管體積、血管表面積、血管厚度均降低(P<0.01)；與STE+siNC組比，STE+siP1組股骨頭內(nèi)血管體積、血管表面積、血管厚度均增多(P<0.01)，見圖5。

圖5 Piezo1沉默對(duì) ONFH大鼠股骨頭組織血管量的影響

與對(duì)照組比，STE組VEGFR2和CD31表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與STE+siNC組比，STE+siP1組VEGFR2和CD31表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖6。

圖6 Piezo1沉默對(duì)VEGFR2和CD31的蛋白表達(dá)量的影響

2.5 Piezo1沉默對(duì)股骨頭壞死大鼠Yap1/β-catenin信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組的股骨頭骨組織中Yap1和β-catenin的蛋白(1.00±0.03，1.00±0.04)比，STE組(3.43±0.23，3.57±0.44)表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與STE+siNC組Yap1和β-catenin的表達(dá)(3.42±0.55，3.61±0.64)比，STE+siP1組(1.85±0.25，2.71±0.34)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖7。

圖7 Western Blot檢測(cè)Piezo1沉默對(duì)Yap1和β-catenin的蛋白表達(dá)量的影響

2.6 激活Yap1/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡并抑制血管生成能力

與Ctrl(1.00±0.06，1.00±0.05)比，Rh-YAP1組中Yap1和β-catenin的蛋白水平(4.21±0.28，2.23±0.25)都增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對(duì)照(Ctrl)組(1.00±0.05)比，ICG-001組β-catenin(4.52±0.45)的蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖8a。

與Ctrl組比，Rh-YAP1組和ICG-001組的細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與Ctrl組比，Rh-YAP1組及和ICG-001組的HUVEC細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成長(zhǎng)度均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖8(b，c)。

圖8 激活Yap1/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡并抑制血管生成能力

3 討論

類固醇可誘導(dǎo)ONFH[5]，其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是關(guān)鍵原因之一[6]。本研究大鼠接受類固醇激素甲基強(qiáng)的松龍的連續(xù)注射后，ONFH模型成功建立。文獻(xiàn)中類固醇所誘導(dǎo)ONFH的股骨頭會(huì)出現(xiàn)明顯的骨壞死，其特征在于STE組的骨小梁中有大量的空骨細(xì)胞陷落，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的骨髓壞死，但發(fā)現(xiàn)ONFH的骨細(xì)胞凋亡率增加[6]，本研究股骨部位骨細(xì)胞凋亡率也明顯增加。Huang等[7]在類固醇誘導(dǎo)的ONFH患者被切除的股骨頭部分也觀察到骨細(xì)胞凋亡，認(rèn)為糖皮質(zhì)激素對(duì)股骨頭的松質(zhì)骨具有直接的細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致凋亡而不是單純的壞死。Zheng等[6]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證明糖皮質(zhì)激素可以促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡。凋亡性骨細(xì)胞的積累可能導(dǎo)致骨壞死，表明具有抑制骨細(xì)胞凋亡潛能的藥物可能具有預(yù)防類固醇誘導(dǎo)的ONFH發(fā)生的能力。

Piezo1對(duì)于骨形成和調(diào)節(jié)骨吸收發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-10]。因此，本研究對(duì)Piezo1在ONFH模型中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，觀察到Piezo1的mRNA水平以及蛋白水平在造模后3 h至24 h都上調(diào)，說(shuō)明Piezo1很可能對(duì)激素性股骨頭壞死有調(diào)節(jié)作用，而沉默Piezo1可以抑制股骨頭壞死組織中骨細(xì)胞的凋亡。

Bax激活ONFH的骨細(xì)胞的凋亡，而Bcl-2選擇性結(jié)合Bax的活性構(gòu)象從而抑制其凋亡[11]。在本研究中，ONFH模型中沉默Piezo1，導(dǎo)致Bax mRNA明顯降低，但Bcl-2 mRNA顯著升高，表明沉默Piezo1可以通過(guò)抑制Bax提高Bcl-2從而抑制骨細(xì)胞凋亡。Caspase-3是另一種重要的凋亡相關(guān)蛋白，屬于Caspase家族，在細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增中起著至關(guān)重要的作用。Caspase-3可被切割形成活性分子促進(jìn)骨細(xì)胞凋亡[11]。在本研究中，ONFH模型中Caspase-3的mRNA升高，意味著由糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡是由Caspase-3執(zhí)行的，而沉默Piezo1可以明顯抑制Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)一步表明Piezo1沉默后可抑制骨細(xì)胞凋亡。

局部缺血和骨壞死是股骨頭骨壞死的核心病理機(jī)制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ONFH出現(xiàn)血管減少，且血管新生關(guān)鍵蛋白VEGFR2和CD3的表達(dá)量下調(diào)。而沉默Piezo1可促進(jìn)大鼠ONFH模型中的股骨頭局部血管的生成，包括血管的體積、表面積和血管厚度在內(nèi)可觀察到明顯的增加，而且骨組織中VEGFR2和CD3蛋白水平明顯上調(diào)。研究證明，Piezo1在胎盤血流敏感性中扮演決定作用，可調(diào)節(jié)胎盤血流[12]，表明沉默Piezo1可能對(duì)ONFH的血管再生有幫助作用。

Yap1和β-catenin信號(hào)通路的協(xié)同作用已被證實(shí)[13-14]，Yap1已被證實(shí)可以調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的血管生成[15]，而β-catenin信號(hào)在多種腫瘤模型和疾病中參與血管生成的調(diào)控，包括股骨頭壞死動(dòng)物[16-17]。在本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果中觀察到，沉默Piezo1明顯抑制Yap1和β-catenin的蛋白表達(dá)，從而抑制Yap1/β-catenin信號(hào)通路的活性。當(dāng)使用Yap1的重組蛋白和β-catenin信號(hào)激活劑時(shí)，成骨細(xì)胞的凋亡率明顯上調(diào)，而且HUVEC細(xì)胞的成管能力部分減弱。說(shuō)明在成骨細(xì)胞中Yap1/β-catenin可能是Piezo1行使功能的關(guān)鍵信號(hào)路徑，且沉默Piezo1通過(guò)抑制Yap1/β-catenin信號(hào)改善股骨頭壞死導(dǎo)致的骨細(xì)胞凋亡和股骨頭血管生成能力的缺失。

綜上所述，沉默Piezo1通過(guò)抗成骨細(xì)胞凋亡和促血管生成預(yù)防類固醇誘導(dǎo)的ONFH，其潛在機(jī)制涉及Bax/Bcl-2、Caspase-3和Yap1/β-catenin信號(hào)通路，說(shuō)明沉默Piezo1是治療ONFH的一種潛在治療方法。