許丹丹，徐雅琴，雋 行，周守標(biāo)，汪昌保，杭 華

（1安徽師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，安徽蕪湖 241000；2安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽蕪湖 241000）

0 引言

菊芋(Jerusalemartichoke)是多年宿根性草本植物，又稱洋姜，鬼子姜[1]。菊芋被稱為“21世紀(jì)人畜共用作物”，在醫(yī)療保健、生態(tài)環(huán)境改善以及功能食品開發(fā)等方面有著重要作用[2]。菊糖具有腸道益生素、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)血糖血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗癌等生理功能[3-4]，其已經(jīng)成為功能性食品的研究熱點(diǎn)。硒(Selenium)作為人體生命必需的微量元素[5]，其是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶不可缺少的組成部分。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是穩(wěn)定生物膜的必需成分和體內(nèi)自由基的捕獲劑；其與VE協(xié)同地保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，防止生成脂褐素，抗衰老，抑癌抗癌和解除重金屬中毒等作用[6]。

近年來(lái)，富硒產(chǎn)品日益增多，尤其是富硒農(nóng)產(chǎn)品及其硒多糖提取也是研究熱點(diǎn)[7]。植物富硒已經(jīng)成為農(nóng)產(chǎn)品功能化與深加工的研究熱點(diǎn)，其產(chǎn)品開發(fā)利用也具有較大的發(fā)展空間和經(jīng)濟(jì)效益[8]。在植物體中，硒多糖是植物體對(duì)無(wú)機(jī)硒進(jìn)行有機(jī)化的主要作用方式。與無(wú)機(jī)硒相比，有機(jī)硒更易被機(jī)體吸收和利用，且安全性較高[9]。硒多糖作為有機(jī)硒的一種，天然獲得產(chǎn)量很低，不能滿足需求，通過(guò)化學(xué)合成的硒多糖，既可保持多糖的基本構(gòu)型和生理功能，又能有效的提高硒的生物利用度，發(fā)揮微量元素硒和多糖的雙重功能[10]。楊銘等[11]從富硒植物中提取純化硒多糖，并對(duì)其與硒的結(jié)合狀態(tài)進(jìn)行研究。Liu X[12]等證明紫花苜蓿硒多糖比天然多糖有更強(qiáng)的抗氧化活性。鄧正春等[13]研究表明菊芋具有較好的富硒能力。

植物多糖的提取方法有微波輔助法、超高壓提取技術(shù)、酶提取法、超聲輔助法、超臨界流體萃取法、雙水相萃取[14]。本研究采用超聲輔助法[15]，利用響應(yīng)面法對(duì)富硒菊芋多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。前期實(shí)驗(yàn)中表明菊芋多糖具有抗氧化性，而富硒菊芋多糖的抗氧化活性有待進(jìn)一步研究。本研究擬采用亞硒酸鈉對(duì)菊芋進(jìn)行富硒種植，以富硒菊芋為試材，對(duì)其提取條件及抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為富硒菊芋多糖的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

富硒菊芋（對(duì)菊芋幼苗拌料施硒，種植獲得富硒菊芋）、普通菊糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品、硒標(biāo)品、亞硒酸鈉、苯酚、濃硫酸、三羥基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、濃硝酸、高氯酸、過(guò)氧化氫(30%)、鐵氰化鉀、鹽酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine,DPPH)、無(wú)水乙醇、Vc、硫酸亞鐵等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)于上海佑科儀器儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA9購(gòu)于上海亞榮生化儀器廠；KH3200E型超聲波清洗器購(gòu)于昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)于上海市三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋購(gòu)于國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；SHZ-D(Ш)循環(huán)水式真空泵購(gòu)于上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)于長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菊芋富硒 在江蘇宿遷附近區(qū)域采集50份菊芋生長(zhǎng)地區(qū)的適宜土壤和50份菊芋，采集后立即密封貯藏。菊芋播種育苗，播種深度10～20 cm，播后30天左右出苗。

實(shí)驗(yàn)：將生長(zhǎng)一致的菊芋幼苗分別移入1.5 kg的塑料花盆中，試驗(yàn)設(shè)1個(gè)空白對(duì)照，并設(shè)5個(gè)試驗(yàn)樣，用亞硒酸鈉進(jìn)行施硒處理，硒含量分別為15、25、50、75、100 mg/kg，隨機(jī)區(qū)組排列且設(shè)置3個(gè)重復(fù)，存放于安徽師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室中。施硒150天收獲。供試土壤理化性質(zhì)為pH 6.56，其余指標(biāo)均符合正常生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.3.2 富硒菊芋多糖的提取工藝 見圖1。

圖1 富硒菊糖的提取工藝流程

1.3.3 除蛋白 采用sevage法除蛋白[16]。

1.3.4 硒含量 采用氫化物-原子熒光光譜法[17]測(cè)定硒含量。

1.3.5 多糖含量 采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，以葡萄糖的質(zhì)量濃度和吸光度值為坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]，得回歸方程：y=8.28x+0.1151，R2=0.9990。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖提取率，見公式(1)。

式中：M0為硒多糖提取量(g)；M1為富硒菊芋原料用量(g)。

1.3.6 多糖提取單因素試驗(yàn) 以富硒菊芋粉末為原料，分別研究超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率以及液料比對(duì)硒多糖提取率的影響。各因素水平為：超聲溫度45、50、55、60、65、70、75℃；超聲時(shí)間50、55、60、65、70、75、80 min；超聲功率250、300、350、400、450、500、550 W；液料比5:1、25:1、45:1、65:1、85:1(mL/g)。

1.3.7 富硒菊芋多糖提取條件響應(yīng)面優(yōu)化 選擇超聲時(shí)間、超聲功率、液料比3個(gè)因素，選用Box-Behnken模型[19]進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以多糖提取率為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

1.3.8 富硒菊芋多糖抗氧化活性研究 以多糖清除·OH、DPPH、O2-·的能力為指標(biāo)，對(duì)利用超聲提取的富硒菊糖與普通菊糖進(jìn)行體外抗氧化活性比較分析。

（1）對(duì)·OH的清除活性的檢測(cè)

①供試溶液的制備：分別配制濃度為10 mg/mL的Se-Inulin和Inulin水溶液，并依次稀釋得到濃度為2、4、6、8、10 mg/mL待測(cè)樣品液，配制同濃度的Vc水溶液；配制10 mmol/L FeSO4和10 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液以及8.8 mmol/L H2O2溶液。

②樣品對(duì)·OH清除活性的檢測(cè)：依據(jù)Fenton反應(yīng)體系中，F(xiàn)e2+和H2O2反應(yīng)生成的·OH可與水楊酸反應(yīng)，可用比色法于510 nm處測(cè)定·OH含量[20]。實(shí)驗(yàn)設(shè)樣品組、空白組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)步驟參考何鋼等[21]的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)公式(2)計(jì)算清除率I。

式中：A空白是空白組的吸光度值；A樣品是樣品組的吸光度值；A對(duì)照是對(duì)照組的吸光度值。

（2）對(duì)DPPH清除能力的測(cè)定[22]

①供試溶液的制備：分別配制濃度為10 mg/mL的Se-Inulin和Inulin水溶液，并依次稀釋得濃度為2、4、6、8、10 mg/mL待測(cè)樣品液，配制同濃度的Vc水溶液；配制0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液。

②樣品對(duì)DPPH清除活性的檢測(cè)：取3個(gè)試管，分別加入1.5 mL DPPH與1.5 mL水、1.5 mL無(wú)水乙醇與1.5 mL多糖溶液、1.5 mL DPPH與1.5 mL多糖溶液，分別設(shè)為空白組，對(duì)照組和樣品組。根據(jù)DPPH具有單電子而使其在517 nm處有一強(qiáng)吸收呈深紫色，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，清除劑與單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，而褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系這一原理[23]，測(cè)定樣品液對(duì)DPPH的清除活性。并按照公式(2)計(jì)算清除率I。

（3）對(duì)O2-·清除能力的測(cè)定

①供試溶液的制備：分別配制濃度為10 mg/mL的Se-Inulin和Inulin水溶液，并依次稀釋得濃度為2、4、6、8、10 mg/mL待測(cè)樣品液，配制同濃度的Vc水溶液；配制pH 8.2 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液；3 mmol/L鄰苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl溶液配制）。

②樣品對(duì)O2-·清除活性的檢測(cè)：采用鄰苯三酚自氧化法，實(shí)驗(yàn)設(shè)樣品組、空白組。樣品組加入1 mL不同濃度的多糖提取液（濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL），實(shí)驗(yàn)步驟參考張曉艷等[24]的實(shí)驗(yàn)，按照公式(3)計(jì)算清除率I。

式中：ΔA空白為線性范圍內(nèi)空白組吸光度的增加值；ΔA樣品為線性范圍內(nèi)樣品組吸光度的增加值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Origin(Version8.5)和 DesignExpert(Version8.0.4)作圖，采用SPSS(Version 17.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著性檢驗(yàn)采用最小顯著差數(shù)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤含硒量對(duì)菊芋塊莖含硒量的影響

由表2可知，在對(duì)土壤進(jìn)行施硒的濃度范圍內(nèi)，施硒80天后，菊芋塊莖的硒含量在0.003～7.132 mg/kg之間。菊芋盆栽土壤施硒后，隨著施硒量的增加，其含硒量與之呈極顯著的正相關(guān)，且施硒組顯著高于空白組。方差分析表明：菊芋塊莖的含硒量在各處理組之間均呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)；在對(duì)土壤進(jìn)行施硒濃度的范圍內(nèi)，盆栽土壤施硒150天后，菊芋塊莖的含硒量在0.121～8.563 mg/kg之間。同樣，隨著施硒量的增加，其含硒量與之呈極顯著的正相關(guān)，且施硒組顯著高于空白組。方差分析表明：菊芋塊莖的含硒量在各處理組之間均呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。在盆栽土壤施硒范圍內(nèi)，菊芋能夠主動(dòng)吸收土壤中的硒并富集在其塊莖處，其硒含量最高可達(dá)到8.563 mg/kg。

表2 盆栽土壤施硒對(duì)菊芋硒積累量的影響

2.2 多糖含量的測(cè)定

制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=8.28x+0.01151，R2=0.9990。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定富硒菊芋多糖與對(duì)照樣品的OD值分別為1.253、0.943，計(jì)算多糖得率分別為13.68%、9.99%。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2(a)-(d)可知，超聲時(shí)間為60 min，超聲溫度為65℃，超聲功率為450 W、每克樣品加液量25 mL為適宜提取條件。由SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析得知，除超聲溫度對(duì)提取率影響不顯著外(P＞0.05)，其余各因素對(duì)多糖的提取率均存在極顯著的影響(P＜0.01)。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)超聲時(shí)間、超聲功率超過(guò)其適宜條件后，多糖提取率分別呈現(xiàn)不同程度的下降，這可能是由于過(guò)長(zhǎng)的超聲波機(jī)械作用和熱效應(yīng)或過(guò)長(zhǎng)/強(qiáng)的微波強(qiáng)熱效應(yīng)，使部分硒多糖發(fā)生降解造成的[25]。

圖2 超聲時(shí)間(min)(a)、超聲溫度(℃)(b)、超聲功率(W)(c)、每克樣品加液量(mL)(d)對(duì)富硒菊糖提取率的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間、超聲功率及液料比3個(gè)因素，采用三因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.2 回歸方程的建立與顯著性檢驗(yàn) 利用SPSS(Version 17.0)軟件，通過(guò)對(duì)多項(xiàng)式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：Y=13.71+0.048A+0.015B-0.91C-0.22AB+0.25AC+0.14BC-1.17A2-0.49B2-1.07C2。該模型的模擬方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，該模型P＜0.0001，表明回歸模型高度顯著；失擬項(xiàng)P=0.9676＞0.05，模型失擬不顯著，實(shí)驗(yàn)誤差?。荒Ｐ拖嚓P(guān)系數(shù)R2=0.9984，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9969，表明此模型擬合優(yōu)度好，因此可用該模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)富硒菊芋多糖提取工藝。此外，液料比及模型各交互項(xiàng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大。

表4 回歸模型方差分析

2.4.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析 以超聲時(shí)間A、超聲功率B、液料比C這3個(gè)影響多糖得率的因素兩兩組合作為自變量，以多糖得率為相應(yīng)指標(biāo)繪制響應(yīng)面，用來(lái)評(píng)價(jià)各因素兩兩組合對(duì)提取得率的交互影響作用，如圖3所示，AB、AC響應(yīng)曲面坡度陡峭，交互作用高度顯著，BC響應(yīng)面相對(duì)陡峭，交互作用顯著。3個(gè)因素中液料比對(duì)多糖提取率影響最大，隨著液料比的增大，硒多糖提取率亦快速上升。

圖3 兩因素交互作用對(duì)富硒菊糖提取率影響的響應(yīng)面分析

2.5 富硒菊芋多糖抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果

2.5.1 對(duì)羥基自由基清除作用的評(píng)價(jià) 由圖4可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，Se-Inulin和Inulin對(duì)羥基自由基的清除作用呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，且隨著多糖質(zhì)量濃度的升高而不斷增強(qiáng)。在最高濃度10 mg/mL時(shí)，Se-Inulin和Inulin對(duì)羥基自由基的清除率分別達(dá)到了80.34%、62.1%，且實(shí)驗(yàn)整體來(lái)看，Se-Inulin的清除效率始終大于Inulin。在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，Inulin對(duì)羥基自由基的清除趨勢(shì)平緩，而Se-Inulin的清除能率不受影響，說(shuō)明硒與多糖的結(jié)合增強(qiáng)了多糖的抗羥基自由基能力。

圖4 Se-Inulin、Inulin和Vc對(duì)·OH自由基清除活性

2.5.2 對(duì)DPPH的清除能力的評(píng)價(jià) 由圖5可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，Se-Inulin和Inulin對(duì)DPPH的清除作用呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系，且隨著多糖質(zhì)量濃度的升高而不斷增強(qiáng)，在最高濃度10 mg/mL時(shí)，Se-Inulin和Inulin的清除率均達(dá)到89.19%、77.23%，由此可說(shuō)明Se-Inulin和Inulin均具有一定的抗氧化活性。此時(shí)Se-Inulin的最大抑制濃度接近于Vc的清除率，證明其有良好的清除DPPH活性的能力。在抗氧化物濃度遞增過(guò)程中，Se-Inulin的清除率均大于Inulin，而且其變化趨勢(shì)非常接近，一定程度上說(shuō)明了Se-Inulin中的硒元素在清除DPPH的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，同羥基自由基清除率趨勢(shì)相同。

圖5 Se-Inulin、Inulin和Vc對(duì)DPPH清除活性

2.5.3 對(duì)超氧自由基的清除能力的評(píng)價(jià) 由圖6可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度2～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)，Se-Inulin和Inulin對(duì)超氧自由基清除率均呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，在最高濃度10 mg/mL時(shí)，Se-Inulin和Inulin對(duì)超氧自由基的清除率十分接近，分別為88.54%、81.82%。同時(shí)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度過(guò)程中，Se-Inulin對(duì)超氧自由基的清除率均大于Inulin。在質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，同DPPH清除率和超氧自由基清除率趨勢(shì)相同。

圖6 Se-Inulin、Inulin和Vc對(duì)O2-·自由基清除活性

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

菊芋富硒的硒含量最高可達(dá)到8.563 mg/kg；響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取菊芋硒多糖最佳工藝條件（超聲時(shí)間60 min、超聲功率450 W、液料比為25:1），提取率達(dá)到(13.52%)；通過(guò)對(duì)比Se-Inulin和Inulin對(duì)羥基自由基、DPPH、超氧自由基的清除活性的研究，Se-Inulin對(duì)自由基具有更好的清除作用。

3.2 討論

多糖的提取條件已經(jīng)成熟，通過(guò)借鑒前人的研究方法，本研究?jī)?yōu)化出富硒菊芋多糖的最佳提取條件。文章對(duì)富硒菊芋粗多糖的抗氧化活性做了初步研究，但菊芋多糖與硒的結(jié)合方式尚不明確，其潛在毒性也有待研究。下一步將展開對(duì)富硒菊芋粗多糖的純化、結(jié)構(gòu)解析、探究其生理功能等工作。