張立全 張浩林 李叢叢 魏建華 張杰偉

摘要：【目的】生長調(diào)節(jié)因子互作因子（ GRF-interacting factor，GIF）是植物體內(nèi)一類轉(zhuǎn)錄共激活因子，在植物生長發(fā)育和逆境脅迫中起重要作用。通過系統(tǒng)分析谷子GIF基因家族的組成、各成員的結(jié)構(gòu)以及進(jìn)化關(guān)系，為GIF基因調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供參考?！痉椒ā坷霉茸踊蚪M數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)的方法，鑒定谷子GIF基因家族的基因結(jié)構(gòu)、染色體定位，編碼蛋白相似性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，通過序列比對(duì)進(jìn)行進(jìn)化和分類分析?！窘Y(jié)果】谷子含有3個(gè)GIF基因，均含有4個(gè)外顯子，分布于第3、8和9號(hào)染色體上。編碼SiGIF1蛋白和SiGIF2蛋白相似性最高，為72.04%，SiGIF1蛋白和SiGIF3蛋白相似性最低，為37.08%。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，谷子GIF蛋白無規(guī)則卷曲占比最高（ 41.56%-56.60%），其次為a-螺旋（34.43%-35.50%），再次為D-轉(zhuǎn)角（5 19%～11.69%），p-折疊最低（3.23%- 11.26%）。TMHMM跨膜區(qū)進(jìn)行分析顯示，谷子GIF蛋白均不含有跨膜區(qū)。MEME保守基序分析顯示，谷子GIF蛋白均含有保守的SSXT（ PF05030）結(jié)構(gòu)域。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析表明谷子GIF蛋白均含有潛在磷酸化位點(diǎn)?！窘Y(jié)論】谷子GIF基因家族的基因結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)等生物信息學(xué)分析結(jié)果將為揭示谷子GIF基因家族在谷子生長發(fā)育過程中的功能提供重要的線索。

關(guān)鍵詞：谷子;生長調(diào)節(jié)因子互作因子;基因家族;進(jìn)化分析

中圖分類號(hào)：S 515

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-03 84（ 2021） 08-0878-06

Bioinformatics of Growth-interacting Factor Genes in Foxtail Millet

ZHANG Liquan 1， ZHANG Haolin 1.2. LI Congcong 1， WEI Jianhua 1*. ZHANG Jiewei 1*

（1. Agro-Biotechnology Research Institute， Beijing Acndemy ofAgriculture and Forestry ScienceslBeijing Key Laboratory of

Agricultural Genetic Resources and Biotechnology. Beijing 100097. China; 2. College ofLife Science.

Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China ）

Abstract： 【 Objective】 The composition， structure. and evolution of each member of the growth-interacting factors （GIF） ofthe growth-regulating factors （GRF） and the transcription cofactors that closely associate with the growth. development， andstress response of plants in Setaria italica were analyzed. 【Method】 Based on the S. italica genome database andbioinformatics. the structure. characteristics， position on the chromosome. proteins similarity， secondary structure，transmembrane domain， and phosphorylation sites of the GIF genes were obtained.【Result】The 3 SiGIFs in S. italicagenome contained 4 exons locating on the 3， 8. and 9 chromosomes. The greatest similarity between SiGIFl and SlGIF2 was72.04%. while the lowest was 37.08% between SiGIFl and SiGIF3. The secondary structure consisted of 41.56%- 56.60%random coils. 34.43 % -35.50% alpha helix， 5.l9% _ 11.69% beta turns and 3 .23 % - 11.26% extended strands. The TMHMMtransmembrane domain analysis showed no transmembrane domain in SiGIFs. MEME indicated that all SiGIFs containedconserved SSXT （PF05030） domain. And potential phosphorylation sites in the GIFs were predicted by analysis.【Conclusion】The bioinformatics revealed information on the structure， phosphorylation sites of SiGIF gene familyprovided crucial insights for the studies on the growth and development of plants.

Key words： Setaria italica; GIF; gene family; phylogeny analysis

0 引言

【研究意義】生長調(diào)節(jié)因子互作因子（ GRF-interacting factor，GIF）是植物體內(nèi)一類轉(zhuǎn)錄共激活因子，屬于SSXT超家族基因，與人類SYT轉(zhuǎn)錄共激活因子同源，在植物生長發(fā)育和逆境脅迫中起重要作用。GIF與植物生長調(diào)節(jié)因子（Growth regulatingfactor，GRF）共同形成功能復(fù)合體，在植物側(cè)生器官的細(xì)胞增殖等過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。共轉(zhuǎn)錄激活因子GIFs通過高度保守的SNH結(jié)構(gòu)域（SSXT）與生長調(diào)節(jié)因子GRFs的N端保守結(jié)構(gòu)域QLQ特異性識(shí)別，形成特定時(shí)空特征的互作復(fù)合物，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等生理過程調(diào)控植株生長發(fā)育進(jìn)程[1-2]。解析谷子（Setaria italica）GIF基因的生物學(xué)功能，對(duì)更好理解C4作物的生長發(fā)育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，擬南芥（Arabidopsis thaliana）GIF的生物功能解析較為完整。擬南芥GIF基因家族共包含3個(gè)成員[3]。擬南芥AtGIF1（也被稱為ANGUSTIFOLIA3，AN3）基因功能缺失突變體gifl因葉片細(xì)胞數(shù)減少導(dǎo)致其葉片變小變窄，而超量表達(dá)AtGIF1基因擬南芥因葉片細(xì)胞數(shù)增多導(dǎo)致葉片變大[4]。擬南芥AtGIF1蛋白不僅可以與擬南芥AtGRF1蛋白的N端保守結(jié)構(gòu)域QLQ直接作用，也可以與擬南芥AtGRF5蛋白相互作用[5]。雙分子熒光互補(bǔ)、免疫共沉淀等試驗(yàn)表明，所有檢測(cè)的AtGIF和AtGRF成員相互作用，并且在植物細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[6-7]。擬南芥AtGIF通過不同通路調(diào)控根分生組織穩(wěn)態(tài)中心（ Quiescent center，QC）和根分生組織大小[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtGIF2和AtGIF3基因的生物學(xué)功能與擬南芥AtGIF1基因的生物學(xué)功能類似，均在植物細(xì)胞分裂調(diào)控中具有重要作用[2]。GIF蛋白和GRF蛋白互作在單子葉植物如水稻和玉米中也得到證實(shí)，GIF蛋白和GRF蛋白相互結(jié)合形成功能復(fù)合體共同發(fā)揮作用[9-10]?！颈狙芯壳腥它c(diǎn)】谷子起源于中國，距今已有8700年的栽培歷史。伴隨我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，作為最大的雜糧作物，谷子日益受到廣大消費(fèi)者的關(guān)注[11]。由中國科學(xué)家主導(dǎo)的谷子“Zhang gu”全基因組序列圖譜的成功構(gòu)建和美國科學(xué)家主導(dǎo)的谷子“豫谷1號(hào)”全基因組測(cè)序結(jié)果均于2012年同期在國際著名雜志《自然生物技術(shù)》發(fā)表[12-13]。最近，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)主導(dǎo)谷子中的模式植物“xiaomi”全基因組測(cè)序的完成[14]，為后續(xù)生物信息學(xué)挖掘、鑒定和分析谷子功能基因提供重要基礎(chǔ)。目前，谷子GIF基因家族的研究尚未見報(bào)道，迫切需要對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用美國能源部谷子（豫谷1號(hào)）基因組數(shù)據(jù)庫，對(duì)谷子GIF基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)、基本特征、推導(dǎo)編碼蛋白、系統(tǒng)進(jìn)化和潛在的磷酸化位點(diǎn)等進(jìn)行分析，為下一步研究特定谷子SiGIF蛋白特定的生物學(xué)功能及其磷酸化修飾提供重要參考。

1材料與方法

1.1谷子GIF基因家族基因組、編碼區(qū)和推導(dǎo)蛋白的獲得

擬南芥GIF基因組、編碼區(qū)和推導(dǎo)蛋白序列下載白TAIR數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org），水稻（OryzasativaL. Spp.Japonica cv.Nipponbare）GIF基因組、編碼區(qū)和推導(dǎo)蛋白序列下載自RAP數(shù)據(jù)庫（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/），谷子（S.italica）GIF基因組、編碼區(qū)和推導(dǎo)蛋白序列下載白Phytozome數(shù)據(jù)庫（https：//phytozomej gi.doe.gov/p z/portal.html#！info？ alias-OrgSitalica）。

分別以水稻GIF基因家族蛋白序列OsGIF1（ LOC Os03952320.1） QsGIF2（ LOC Osllg40100.3）和OSGIF3（ LOCOs12931350.1）為參比序列，利用Phytozome數(shù)據(jù)庫（Setaria italica v2.2）中Blast程序進(jìn)行BlastP檢索，再利用NCBI提供的CDS軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）預(yù)測(cè)這些蛋白是否存在GIFs蛋白保守SSXT結(jié)構(gòu)域，存在該結(jié)構(gòu)域的推導(dǎo)蛋白序列屬于谷子GIF基因家族成員。

1.2谷子GIF基因家族基本結(jié)構(gòu)分析

將獲得的谷子SiGIFs的基因組序列和編碼區(qū)序列利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析[15]。將獲得的谷子SiGIFs蛋白利用TMHMMServer v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析[16]，將獲得的谷子SiGIFs蛋白利用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page-npsasopma.html）進(jìn)行a一螺旋、p一折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)分析[17]。谷子SiGIFs蛋白之間的氨基酸相似性利用歐洲生物信息研究所ClustalOmega T具（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行分析[18]。

1.3谷子GIFs蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

將3個(gè)擬南芥GIF蛋白、3個(gè)水稻GIF蛋白和鑒定出的谷子GIF蛋白保守基序應(yīng)用MEME軟件（http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）進(jìn)行分析[15]。參數(shù)設(shè)置如下：基序的最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目是2個(gè)，其他參數(shù)設(shè)置為程序默認(rèn)值。

鑒定出的谷子、擬南芥和水稻的GIF蛋白利用ClustalX（ 2.0）[19]軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，GIFs蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹使用MEGA 6.0[20]軟件構(gòu)建，程序采用鄰接（Neighbor-joining，NJ）算法，進(jìn)行1000次Bootstrap抽樣。

1.4谷子GIFs蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)分析

分別對(duì)鑒定出的谷子GIFs蛋白序列利用NetPhos3.1 Server軟件[21]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/）進(jìn)行潛在的磷酸化位點(diǎn)分析，程序中涉及的參數(shù)均選用默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1谷子GIF基因家族成員的鑒定和命名

根據(jù)水稻中已經(jīng)鑒定出來的3個(gè)GIF蛋白序列，分別利用JGI數(shù)據(jù)庫的Blast程序中進(jìn)行BlastP，得到了3個(gè)谷子（S italica）候選GIF基因。利用保守域在線預(yù)測(cè)軟件CDS進(jìn)行驗(yàn)證GIF保守域SNH結(jié)構(gòu)域（ SSXT）的存在，據(jù)此確定谷子包含3個(gè)GIF基因。谷子GIF基因分布在第3、8和9號(hào)染色體上，根據(jù)他們?cè)谌旧w上的基因座分別命名為SiGIF1～3（圖1），對(duì)應(yīng)的基因座分別為Seita.3G360000、Seita.8G193300和Seita.9G104500，轉(zhuǎn)錄本分別為Seita.3G360000.1、Seita.8G193300.1和Seita.9G104500.1，別名分別為Si023367m.g、Si026850m.g和Si037326m.g基因長度為561～696個(gè)堿基不等，外顯子個(gè)數(shù)均為4個(gè)，編碼蛋白長度為186～231個(gè)氨基酸不等（表1）。

2.2谷子GIF基因家族結(jié)構(gòu)分析

利用Clustal Omega對(duì)谷子SiGIFs推導(dǎo)編碼蛋白的氨基酸序列的相似性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，谷子SiGIF1蛋白和谷子SiGIF2蛋白相似性最高，為72.04%;谷子SiGIFI蛋白和谷子SiGIF3蛋白相似性最低，為37.08%，谷子SiGIFI蛋白和谷子SiGIF2蛋白相似性為39.11%。利用SOPMA對(duì)谷子SiGIFs推導(dǎo)編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)谷子SiGIFs蛋白中無規(guī)則卷曲的比例最高（41 56%～56.60%），其次為a-螺旋（34.43%～35.50%），再次為p一轉(zhuǎn)角（5.19%～11.69%），p-折疊（3.23%～11.26%）最低。利用TMHMM對(duì)谷子SiGIFs推導(dǎo)蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示谷子SiGIFs蛋白均不含有跨膜區(qū)。

使用MEME保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)軟件對(duì)擬南芥、水稻和谷子GIFs蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明，擬南芥、水稻和谷子GIFs蛋白均包含高度保守的SNH結(jié)構(gòu)域。其中，第一個(gè)基序是位于蛋白N端的SNH結(jié)構(gòu)域，P值為1.8×10_253。無論在單子葉植物水稻和谷子中，還是在雙子葉植物擬南芥中，GIFs蛋白均含有SNH結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域，表明GIFs蛋白在進(jìn)化過程中具有高度保守的結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2.3谷子GIFs系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用進(jìn)化樹分析軟件MEGA 6.0對(duì)擬南芥、水稻、谷子共9個(gè)GIFs蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果（圖3）顯示：擬南芥、水稻和谷子GIFs蛋白并沒有完全按照物種聚類在一起，而是混合分布。他們按照系統(tǒng)進(jìn)化樹可以分為3個(gè)亞家族，其中，水稻OsGIFl與谷子SiGIF3、擬南芥AtGIFI～3聚類在一起，推測(cè)谷子SiGIF3和水稻OsGIFI可能具有與雙子葉植物擬南芥AtGIF1～3相似的進(jìn)化過程和生物學(xué)功能。谷子SiGIF2和水稻的OsGIF2、谷子SiGIFI和水稻的OsGIF3聚類在一起，推測(cè)他們可能具有相似的生物學(xué)功能。

2.4谷子SiGIFs蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

利用NetPhos 3.1 Serverl對(duì)谷子SiGIFs蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)谷子SiGIFs蛋白中均存在潛在磷酸化位點(diǎn)，主要以絲氨酸和蘇氨酸的形式存在，絡(luò)氨酸的形式最少（圖4）。其中，谷子SiGIF3的潛在磷酸化位點(diǎn)中是唯一僅含有2個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。谷子SiGIFI含有15個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，包括8個(gè)絲氨酸位點(diǎn)和7個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)。谷子SiGIF2含有12個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，包括5個(gè)絲氨酸位點(diǎn)和7個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)（表3）。

3討論

伴隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，很多植物的高質(zhì)量基因組被成功解析，為從全基因組水平分析和鑒定植物基因家族提供了便利[21]。GIF基因家族已經(jīng)在擬南芥[3]、水稻[22]、小麥（Triticum aestivumL）[23]、野生二粒小麥（T.dicoccoides）[23]、烏拉爾圖小麥（T. urartu）[23]、粗山羊草（Ae.tauschii）[23]中鑒定，截至目前，谷子GIF基因家族尚未鑒定。本研究鑒定出谷子GIF基因家族中包含3個(gè)成員，而已鑒定的擬南芥、水稻、小麥、野生二粒小麥、烏拉爾圖小麥和粗山羊草GIF基因家族分別含有3、3、8、6、3和3個(gè)成員，推測(cè)在生物進(jìn)化過程中，GIF基因可能在小麥和野生二粒小麥基因組中經(jīng)歷了不斷發(fā)生譜系的特異擴(kuò)張和拷貝。谷子SiGIFs均含有4個(gè)外顯子，谷子SiGIFs蛋白均含有SNH結(jié)構(gòu)域，表明GIF基因家族在植物中具有高度保守性，據(jù)此推測(cè)GIF轉(zhuǎn)錄因子作為GRF的共轉(zhuǎn)錄因子共同參與對(duì)下游靶基因的調(diào)節(jié)[24]。而不同植物中含有的成員數(shù)目各不相同，推測(cè)不同的GIF蛋白可能在特定的組織響應(yīng)特定外界刺激從而精細(xì)調(diào)節(jié)植物各生理過程[24]。

進(jìn)化分析表明，植物GIFs蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹基本上按照單子葉植物和雙子葉植物分別聚類，據(jù)此推測(cè)GIF蛋白可能在單子葉植物和雙子葉植物中各自具有類似的生物學(xué)功能，暗示植物GIF蛋白在進(jìn)化過程中可能具有不同的進(jìn)化過程。谷子SiGIFI和水稻OsGIF3、谷子SiGIF2和水稻OsGIF2同源性較高，結(jié)構(gòu)域分析也表明，谷子SiGIF1和水稻OsGIF3、谷子SiGIF2和水稻OsGIF2具有類似的保守基序，表明他們可能具有有別于水稻OsGIF1的單子葉植物特有的生物學(xué)功能。谷子SiGIF3和OsPLC1、AtGIFI～3同源性較高。水稻OsGIF1與OsGRF4直接互作形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，通過對(duì)下游靶基因作用，從而凋節(jié)水稻粒型[25]。最近研究發(fā)現(xiàn)，水稻Os GRF1可能通過精準(zhǔn)調(diào)控OsGIFI特異性介導(dǎo)葉片生長[22]，表明聚類在一起的同源基因可能具有不同的生物學(xué)功能，因此不能按照系統(tǒng)進(jìn)化樹中的聚類關(guān)系簡單推測(cè)谷子SiGIFs各成員的生物學(xué)功能。谷子中特定SiGIF的功能還需要從谷子中克隆后逐一解析其生物學(xué)功能。

植物主要通過蛋白質(zhì)來行使其生物學(xué)功能，磷酸化是最常見的一類蛋白質(zhì)翻譯后修飾，其主要通過蛋白激酶或磷酸酶在特定絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的羥基上增加或去除一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)，從而有效地改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[26]。擬南芥生長素生物合成中的關(guān)鍵酶色氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ Tryptophanaminotransferase of Arabidopsis，TAAl）的101位蘇氨酸被轉(zhuǎn)膜激酶4（ Tans-membrane kinase 4.TMK4）磷酸化修飾后，調(diào)節(jié)了生長素生物合成，同時(shí)調(diào)節(jié)根分生組織和根毛的發(fā)育[27]。目前，谷子SiGIFs蛋白確切的生物學(xué)功能尚未見報(bào)道。磷酸化分析表明，谷子SiGIFs蛋白存在潛在磷酸化位點(diǎn)，暗示谷子SiGIFs蛋白可能通過磷酸化的方式來精細(xì)調(diào)節(jié)其生物學(xué)功能。

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（責(zé)任編輯：張梅）

收稿日期：2021-0307初稿;2021-0606修改稿

作者簡介：張立全（ 1962-），男，副研究員，研究方向：谷子優(yōu)質(zhì)育種（E-mail： zhanglql962@163.com）：共同第一作者：張浩林（1997-），男，

碩士研究生，研究方向：谷子優(yōu)質(zhì)育種（E-mail： 370842440@qq.com）

*通信作者：魏建華（1971-），男，研究員，研究方向：分子生物學(xué)（E-mail： weijianhua@baafsnetcn）;張杰偉（1982-），男，副研究員，研究方向：谷子優(yōu)質(zhì)分子育種（E-mail： jwzhang919@163com）

基金項(xiàng)目：圍家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)日（2019YFDl000700、2019YFDl000703）：北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)（KJCX20200205、KJCX20210101）