張麗芳 李艷瓊 蔡建 高秀 徐晴芳 劉威良 楊衛(wèi)星 胡海林

摘要：【目的】分析根結(jié)線蟲對馬鈴薯根際土壤真菌群落多樣性的影響?！痉椒ā客ㄟ^高通量測序技術(shù)、土壤性質(zhì)測定及生物信息學技術(shù)分析感染根結(jié)線蟲馬鈴薯和健康馬鈴薯根際土壤真菌群落多樣性差異?！窘Y(jié)果】從6個土壤樣品中共獲得3界12門34綱77目171科332屬526種的土壤真菌。對物種多樣性指數(shù)分析后，發(fā)現(xiàn)感染根結(jié)線蟲馬鈴薯病株與健康馬鈴薯植株的根際土壤真菌群落多樣性和土壤性質(zhì)均存在顯著性差異。對6個樣品進行物種組成分析后，在門水平中，感病植株根際土壤真菌Basidiomycota豐度較健康植株根際土壤真菌豐度高，Ascomycota豐度低于健康植株根際土壤;在科水平中，病株根際土壤豐度較高的菌群有Nectriaceae和Trimorphomycetaceae;在屬水平中，健康植株根際土壤豐度較高的菌群為鐮刀菌屬Fusarium、被孢霉屬Mortierella和未知分類毛殼菌科屬unclassified_f_Chaetomiaceae?！窘Y(jié)論】感染根結(jié)線蟲的馬鈴薯與健康馬鈴薯根際土壤真菌群落豐度在門、科和屬水平上均存在差異，為進一步研究馬鈴薯根結(jié)線蟲的發(fā)生和防治提供了新的思路。

關(guān)鍵詞：根結(jié)線蟲;馬鈴薯根際土壤;土壤性質(zhì);高通量測序;真菌多樣性

中圖分類號：S154;S 532

文獻標志碼：A

文章編號：1008-03 84（2021）08-0936-06

High-Throughput Sequencing on Fungal Diversity in Potato Rhizosphere Soil

Infested by Root-knot Nematodes

ZHANG Lifang 1， LI Yanqiong 2， CAI Jian 1. GAO Xiu 1， XU Qingfang 1. LIU Weiliang 1， YANG Weixing 1， HU Hailin 3*

（I. Yunnan Engineering Research Center of Fruit Wine， Qujing Normal University， Qujing， Yunnan 65501I， China; 2. Collegeof Agronomy and Life Sciences， Kunming University Kunming， Yunnan 6502 14. China; 3. College of Mathematics andStatistics， Qujing Normal University Qujing， Yunnan 65501I. China ）

Abstract： 【Objective】Diversity of the thizosphere soil fungal community in potato field as affected by the presence of root-knot nematodes was investigated using high-throughput sequencing technique. 【Methods】The properties and bioinformaticsof thizosphere soils surrounding healthy and infested potato plants were compared to analyze the possible effects of differentialfungal community on the occurrence and control of the disease. 【Results】There were 526 fungi species belonging t0 332genera. 171 families. 77 0rders. 34 classes， 12 phyla， and 3 kingdoms identified from the 6 field specimens. Significantlydifferentiations on the fungal community diversity and properties of the thizosphere soils on the healthy and infested potato lotswere found. In the infected areas， Basidiomycota was the more abundant phylum， but Ascomycota less， than on the healthy lots.At family level. Nectriaceae and Trimorphomycetaceae were more abundantly found in the soil of diseased plants， while atgenus level， Fusarium. Mortierella， and some unclassified Chaetomiaceae more richly in the soil of healthy plants.【Conclusion】Significant differences in the abundance of fungi in the thizosphere soils of potatoes infested by the root-knotnematodes and the healthy counterparts were found at phylum， family， and genus levels. The information would aid furtherstudy on the occurrence and control of potato root-knot nematodes.

Key words： Root-knot nematodes; potato thizosphere soils; soil properties; high throughout sequencing technology; fungidiversity

0 引言

【研究意義】馬鈴薯Solanum tuberosum L隸屬茄科茄屬，是世界上第四大糧食作物，是云南省三大糧食作物之一，據(jù)云南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，截至2018年底，云南省馬鈴薯種植面積達5.628×10s hm2，產(chǎn)量（折糧）209.2萬t，云南省馬鈴薯種植面積、總產(chǎn)量均居全國第3位，同時也是根結(jié)線蟲的主要寄主之一?！厩叭搜芯窟M展】近年來，微生物多樣性指標作為重要的土壤健康指標受到廣泛的關(guān)注，而馬鈴薯根結(jié)線蟲的侵染主要從根部開始侵染，同時促使根際土壤中的菌群更容易感染植株。據(jù)報道，國內(nèi)外馬鈴薯寄生性線蟲至少有24屬68種，其中一些種類嚴重危害馬鈴薯的生產(chǎn)，我國已報道的馬鈴薯寄生線蟲有16屬44種，大多數(shù)是墊刃屬、滑刃屬等，馬鈴薯根結(jié)線蟲屬墊刃目線蟲病害。在這些植物病原線蟲中，馬鈴薯根結(jié)線蟲Meloidogyne spp.占損失的50%以上[1-3]。根結(jié)線蟲在土壤中受許多微生物影響，線蟲寄生真菌被認為是自然條件下控制線蟲的主要因子之一[4-7]，所以推測感染根結(jié)線蟲的馬鈴薯和健康馬鈴薯根際微環(huán)境土壤間存在差異。每棵植株所處的土壤成分、施肥情況和健康狀態(tài)等微環(huán)境都會有細微的差別.都能靈敏地反映在其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)上，而表現(xiàn)出一種植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，就其豐度而言，數(shù)量在300～55 000[8-12]。然而，馬鈴薯植株健康狀態(tài)變化與根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，土壤微生物菌群對調(diào)節(jié)植株根際微環(huán)境起到很大作用。利用傳統(tǒng)的方法獲得的微生物僅占環(huán)境微生物的0.1%～1.0%[13]，無法全面反映環(huán)境微生物群落的真實狀況。近年來，隨著新一代測序技術(shù)的快速發(fā)展，利用Illumina Mi Seq高通量測序技術(shù)，現(xiàn)代生物信息學手段，可獲得龐大的數(shù)據(jù)信息，該技術(shù)具有高通量、價格低、運行周期短的優(yōu)勢，已被廣泛應用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究[14-17]?！颈狙芯壳腥朦c】利用Illumina Mi Seq高通量測序技術(shù)探討感染根結(jié)線蟲的馬鈴薯和健康馬鈴薯根際微環(huán)境土壤間真菌群落差異有待深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用Illumina MiSeq測序技術(shù)對云南省曲靖市馬龍縣馬鈴薯生產(chǎn)基地健康馬鈴薯和感染根結(jié)線蟲的馬鈴薯根際土壤真菌群落進行測序分析，探索其根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異及其影響因素，為感染根結(jié)線蟲的馬鈴薯根際土壤微環(huán)境改善，病害防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1土壤樣品采集地概況

試驗地位于云南省曲靖市馬龍縣月望鄉(xiāng)范家新屯馬鈴薯種植區(qū)，經(jīng)度103°63'，緯度25°33'，海拔2090.00 m，屬低緯度高原季風氣候，年平均氣溫13.6℃，年均降水量1001.8 mm，每年平均日照1985h以上，縣城年均氣溫13.4℃，每年無霜期24ld。冬無嚴寒，夏無酷暑，日照較長，熱量不足，雨量充沛，但干冷同期，雨熱同季，干濕分明，降水集中。各采樣田的氣候條件、栽培管理措施和水肥用量基本一致。土壤類型為磚紅壤。

1.2土壤樣品采集方法

在6塊試驗田中，按照5點采樣法采集20 cm深的土壤樣品，去除石塊和大顆粒雜質(zhì)，抖落根際土壤，進行混裝后帶回實驗室，用20目的篩子過篩，處理組和對照組分別標記為MLE1，MLE2，MLE3，MLCKI，MLCK2，MLCK3.每個處理4個重復，分裝至無菌離心管中，1份用于土壤性質(zhì)測定，另外3份密封后立即放入-80℃冰箱，用于DNA提取。

1.3土壤性質(zhì)測定

土壤pH采用pH酸度計測定，有機質(zhì)（SOM）含量采用重鉻酸鉀氧化容量法測定，速效氮（ AN）含量采用堿解擴散法測定，速效磷（AP）含量以NH4F_HC1溶液提取后采用紫外可見分光光度計測定，速效鉀（ AK）含量采用1.0 mol.L-l乙酸銨浸提后以火焰光度計測定。

1.4高通量測序分析

土壤樣品送至美吉生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司進行DNA提取和高通量測序。擴增引物為ITSIF（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）.ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）擴±曾片段長度為300 bp[18]。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorrM_ST藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進行檢測定量，按照相應比例的混合后進行Miseq文庫構(gòu)建、拼接質(zhì)控、OTU聚類、數(shù)據(jù)分析與信息挖掘。土壤性質(zhì)和真菌群落多樣性均采用SPSS17.0進行分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同樣品土壤性質(zhì)分析

由表1可知，6種樣品根際土壤pH均偏酸性，其中，健康馬鈴薯根際土壤pH稍偏高，感染根結(jié)線蟲的馬鈴薯根際土壤pH酸性略強，二者間存在差異顯著性（P<0.05）。土壤有機質(zhì)含量（ OM）、速效磷（ AP）、速效鉀（AK）和速效氮（AN）均存在差異顯著性（P<0.05），總體而言，以上4種物質(zhì)含量在健康馬鈴薯根際土壤中含量略高。

2.2樣品稀釋曲線分析

由圖1可知，樣品的稀釋曲線呈平穩(wěn)趨勢發(fā)展，未達到飽和?？梢姡m然取樣、測試數(shù)據(jù)均存在科學性，樣品信息存在較高的客觀土壤環(huán)境真菌群落構(gòu)成置信度，可客觀體現(xiàn)土壤樣本各自真菌群落，但也存在未發(fā)現(xiàn)部分少量微生物的可能性，說明測序結(jié)果可以反映樣品當中的絕大多數(shù)真菌信息。

2.3測序序列統(tǒng)計及多樣性指數(shù)分析

根據(jù)測序獲得的原始序列和有效序列分析可知（表2），所有序列經(jīng)質(zhì)控分析得到的有效序列占比均在96%以上，說明原始序列利用率較高，絕大部分都可用作后續(xù)數(shù)據(jù)分析。各土壤真菌多樣性指數(shù)覆蓋率均為99.7%，說明測序數(shù)據(jù)合理真實，測序數(shù)據(jù)基本涵蓋了馬鈴薯根際土壤中的真菌類群，能體現(xiàn)馬鈴薯根際土壤真實環(huán)境中真菌特征。通過SPSS統(tǒng)計軟件分析，感染根結(jié)線蟲馬鈴薯根際土壤真菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)為2.59～4.19，Simpson指數(shù)為0.05～0.26，Ace指數(shù)為574.26～1013.8，Chao指數(shù)為586.14～1025.57，其中，感染根結(jié)線蟲馬鈴薯根際土壤真菌菌落的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)與健康馬鈴薯根際土壤真菌群落均存在顯著性差異。從多樣性指數(shù)可看出，健康馬鈴薯根際土壤Shannon指數(shù)大于感染根結(jié)線蟲馬鈴薯根際土壤，而Simpson指數(shù)恰好相反，說明健康馬鈴薯根際土壤真菌群落多樣性更高。由Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可看出，健康馬鈴薯根際土壤真菌群落豐富度均高于處理組，說明健康馬鈴薯根際土壤真菌群落豐富度高于處理組。

2.4物種組成分析

2.4.1物種組成Venn圖分析 由圖2可直觀比較出兩大組樣品中OTU數(shù)目組成情況，兩組樣品中共有OTU數(shù)548個，占全部OTU的2g%，MLE組特有OTU數(shù)為189，占全部OTU的10%;MLCK組OTU數(shù)594，占全部OTU的32%，由此看出兩大組樣品中真菌分布差異明顯。

2.4.2土壤真菌群落組成 6個土壤樣品測序共獲得3界12門34綱77目171科332屬526種的土壤真菌。

2.4.3真菌在門水平上比較 對MLEI、MLE2、MLE3、MLCKI、MLCK2、MLCK3共6個樣品中的真菌群落分別求和后，對6個樣品做柱狀圖分析，結(jié)果如圖3所示，6個樣品豐富度相似，6個樣品中豐度占優(yōu)勢的菌門均為擔子菌門Basidiomycota，子囊菌門Ascomycota和球囊菌門 Mortierellomycota， 而MLCK1、MLCK2和MLCK3中子囊菌門Ascomycota和球囊菌門Mortierellomycota略高于另外3個樣品。

2.4.4真菌在科水平上比較 如圖4所示，6個樣品在科水平上存在差異，MLCKI、MLCK2和MLCK3中真菌菌群豐富度高于另外3個樣品，MLE1、MLE2和MLE3中豐度較高的菌群有赤殼科Nectriaceae、Trimorphomycetaceae、被孢霉科Mortierellaceae、 毛殼菌科Chaetomiaceae和裸囊菌科Gymnoascaceae，而MLCKI、MLCK2和MLCK3中豐度較高的菌群有赤殼科Nectriaceae、被孢霉科Mortierellaceae和毛殼菌科Chaetomiaceae。

2.4.5真菌在屬水平上比較 如圖5所示，6個樣品中主要菌群為沙蜥屬Saitozyma、鐮刀菌屬Fusarium、被孢霉屬Mortierella、未知分類毛殼菌科屬unclassifiedf_Chaetomiaceae和赤霉菌屬Gibberella，在MLEI、MLE2和MLE3中豐度較高的菌屬為Saitozyma，而Fusarium和Mortierella次之。在MLCK1、MLCK2和MLCK3中豐度較高的菌屬為Fusarium、Mortierella和unclassified_f_ Chaetomiaceae.

3討論與結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)分析了感染根結(jié)線蟲馬鈴薯根際土壤真菌多樣性及其群落組成，結(jié)果表明，從物種組成韋恩圖可看出，健康植株根際土壤的OTU數(shù)量較感病植株根際土壤多，在門水平中，感病植株根際土壤真菌Basidiomycota豐度較健康植株根際土壤高，Ascomycota豐度低于健康植株根際土壤;在科水平中，病株根際中豐度較高的菌群有Nectriaceae和Trimorphomycetaceae; 在屬水平中，健康植株根際土壤中豐度較高的菌群為Fusarium、Mortierella、unclassified_f_Chaetomiaceae和Plectosphaerella。健康植株根際土壤真菌群落Ascomycota高的原因可能是Ascomycota都是寄生或腐生，部分感病植株根系腐爛，根際分泌物大量減少甚至無分泌物，造成Ascomycota賴以寄生的根際營養(yǎng)成分下降，所以感病植株根際土壤中Ascomycota豐度降低;相反，感病植株根際土壤中Basidiomycota豐度高的原因是由于病根腐爛過程中，與植株具有共生關(guān)系的擔子菌門Basidiomycota勢必緊急動員，通過與植物形成共生菌根來抵御或彌補根結(jié)線蟲感染對植株的傷害[19-20]，所以表現(xiàn)出其豐度顯著提高。在科水平中，Nectriaceae豐度高的原因可能是Nectriaceae是一種導致植株形成叢枝菌根并致使根際腐爛的致病菌，所以豐度偏高，與Nonaka等研究[6.21]相符。本研究中感染根結(jié)線蟲的馬鈴薯根際土壤真菌群落的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon-wienner指數(shù)趨勢相同，而與pH相反;Simpson指數(shù)與有機質(zhì)、速效氮、速效磷及速效鉀含量變化相反，說明土壤真菌豐度和多樣性與土壤養(yǎng)分含量密切相關(guān)，下一步將進一步明確其相關(guān)性，通過各種手段改善土壤pH和理化性質(zhì)等因素改變土壤真菌群落結(jié)構(gòu)來控制根結(jié)線蟲病害的擴展和蔓延。

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（責任編輯：林海清）

收稿日期：2021-0308初稿;2021-06-19修改稿

作者簡介：張麗芳（ 1987-），女，博士，講師，研究方向：植物病理（E-mail： 752859175@qq.com）

*通信作者：胡海林（ 1986-），男，碩士，助教，研究方向：馬鈴薯病害（E-mail： 243902676@qq.com）

基金項目：云南省科技計劃計劃青年項目（2018FD080）：曲靖師范學院青年項目（2019QN002）