許泳清 李華偉 張鴻 李國良 林趙淼 邱永祥 邱思鑫

摘要：【目的】建立快速檢測甘薯卷葉病毒重組酶聚合酶（ RPA）等溫擴增方法，為甘薯卷葉病毒（sweet potatoleaf curl virus，SPLCV）提供快速、簡便的檢測方法?！痉椒ā扛鶕?jù)甘薯卷葉病毒AV1基因的保守區(qū)段設(shè)計RPA檢測用引物，并對引物進行篩選，對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行優(yōu)化，建立SPLCV的RPA檢測方法?！窘Y(jié)果】建立的甘薯卷葉病毒RPA方法快速簡便，39℃反應(yīng)20 min完成檢測;靈敏度高，最低檢測限為10 pg· uL-1;特異性強，與感染番茄黃化卷葉病毒（ TYICD），甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）、甘薯G病毒（SPVG）、甘薯退綠矮化病毒（ SPCSV）等4種DNA病毒均無交叉反應(yīng)?！窘Y(jié)論】建立的RPA檢測方法具有快速、靈敏、特異性強、小需要特殊儀器等優(yōu)點，適合田問甘薯卷葉病毒樣品的快速檢測。

關(guān)鍵詞：甘薯;卷葉病毒（ SPLCV）;重組酶聚合酶等溫擴增方法;檢測

中圖分類號：S 435

文獻標志碼：A

文章編號：1008-03 84（ 2021） 08092304

A Rapid Detection Method on RPA of Sweet Potato Leaf Curl Virus

XU Yongqing， LI Huawei， ZHANGHong. LI Guoliang， LIN Zhaomiao， QIU Yongxiang， QIU Sixin*（ Crop Research Institute . Fujian Academy of Agricultural Sciences/Scientific Observation and Experimentation Station on Tuber andRoot Crops in South China. Ministry of Agriculture/Dry Crop Engineering Research Center ofFujian Province. Fuzhou Fujian 3500 13. China ）

Abstract： 【Objective】 A rapid isothermal amplification method for detecting the recombinant enzyme polymerase （RPA） insweet potato leaf curl virus （SPLCV） was established. 【Method】 A set of primers for RPA detection was designed based onthe AVl gene selected from SPLCV sequence. Reaction conditions for the detection was optimized and verified forapplicability. 【Result】The newly established methodology took merely 20m to complete the nucleic acid amplification at39℃， which greatly improved the detection efficiency.

More importantly， the method was specific toward SPLCV and free ofany cross reaction with DNAs of other pathogens， such as TYLCD. SPFMV. SPVG. or SPCSV. It also showed a highrepeatability and a minimum detection limit on RPA of 10 pg·yL-1. 【Conclusion】The newly developed method for SPLCVidentification based on the detection of RPA in sweet potatoes was rapid， accurate， specific， repeatable. and easy to operate inthe field.

Key words： Sweet potato; sweet potato leaf curl virus （SPLCV）; RPA; detection methodology

0 引言

【研究意義】甘薯是以塊根或秧蔓進行繁殖的無性繁殖作物，常會受到病毒的侵染，病毒侵染甘薯后會繼代相傳，從而影響甘薯的正常生長發(fā)育，造成種性退化。而甘薯卷葉病毒（Sweet potato leafcurl virus.SPLCV）是由煙粉虱（Bermisia tabaci）以持久方式傳播并侵染甘薯的最主要病毒之一[1-2]。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甘薯的產(chǎn)區(qū)每年均有發(fā)生危害，發(fā)生嚴重的導(dǎo)致甘薯絕產(chǎn)，對薯農(nóng)的收益造成巨大影響。甘薯卷葉病毒屬雙生病毒科（ Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）成員，SPLCV是典型的DNA病毒[3]。SPLCV侵染甘薯后，甘薯植株會出現(xiàn)葉片卷曲、壞死、花葉等癥狀。近年來，隨著各地之間種苗交換頻繁，在山東、河北、河南、廣東、江蘇和福建等地均有甘薯曲葉病毒發(fā)生的報道[4-6]。目前，生產(chǎn)上還沒有特效藥防治病毒病，因此，亟需建立一種速度快、效率高、實用強的檢測方法，應(yīng)用于大田生產(chǎn)，加強監(jiān)測和防控，為甘薯病毒病的防治奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】目前檢測雙生病毒有傳統(tǒng)方法和聚合酶鏈式反應(yīng)（ Polymerasecham reaction，PCR）分子檢測方法。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測假陽性率較高，PCR檢測方法需要昂貴的專業(yè)儀器，且擴增時間較長，不適合野外及基層單位應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（ loop-mediated isothermalamplification，LAMP）是一種快速、靈敏、特異和可視化的檢測技術(shù)[7]，該技術(shù)采用4條特異引物識別靶序列上6個特異區(qū)，利用DNA鏈置換聚合酶（BstDNApolymerase）在恒溫條件下對靶基因擴增，具有便捷、快速、準確等優(yōu)點，但LAMP在檢測過程中會產(chǎn)生氣溶膠，出現(xiàn)假陽性。2006年英國TwistDx Inc公司新研發(fā)了重組酶聚合酶擴增（ Recombinase PolymeraseAmplification RPA）技術(shù)，該技術(shù)被公認為可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的PCR核酸檢測技術(shù)[8]。近年來RPA廣泛應(yīng)用于很多病原菌的檢測。Boyle等[9]開發(fā)出一種實時的RPA方法，可以快速、靈敏檢測結(jié)核分歧桿菌的目標基因。Daher等[10]研究表明RPA能夠在20 min內(nèi)檢測出孕婦體內(nèi)是否感染B鏈球菌，同時可以實現(xiàn)多重檢測?！颈狙芯壳腥朦c】由于RPA檢測技術(shù)靈敏、特異、快速（檢測時間縮短至20 min）不需要特殊儀器等優(yōu)點，在動植物病原菌檢測上得到了廣泛的應(yīng)用[11-13]。而應(yīng)用該技術(shù)在甘薯病原物的檢測尚待深入研究，建立甘薯病毒RPA快速檢測技術(shù)在甘薯病毒病快速診斷具有廣泛的應(yīng)用前景。【擬解決關(guān)鍵問題】根據(jù)甘薯卷葉病毒AVI基因的保守區(qū)段設(shè)計一對RPA檢測用引物，并對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行優(yōu)化，以期建立SPLCV的RPA檢測方法。

1材料與方法

1.1材料及DNA提取

試驗于2019- 2020年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所進行。感染SPLCV的樣品（甘薯葉片組織）采集于福建省福州市福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所和莆田市秀嶼區(qū)，樣品用液氮處理后保存于80℃超低溫冰箱中備用。

將被SPLCV侵染和健康的組織進行DNA提取，以健康組織提取的DNA為陰性對照。采用CTAB法提取DNA，提取試劑盒購白北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenB ank公布的SPLCV較保守的AV1基因序列為靶標基因，應(yīng)用primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計1對特異性引物。并由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.3 RPA反應(yīng)體系的建立

RPA反應(yīng)體系50 uL，其中含模板DNA 2 uL，Rehydration Buffer 29.5 uL、引物F和R各2.4 uL、ddH20 11.2 uL、最后再加入醋酸鎂溶液（MgOAc）2.5 uL（ 280 mmol·L-1），50 uL反應(yīng)體系加入凍干酶粉中，39℃反應(yīng)20 min。冰上終止反應(yīng)。取5uL RPA產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠為電泳支持介質(zhì)，在0.5×TBE和120 V電壓下電泳40 min，用紫外透射儀觀察。

1.4 RPA特異性及靈敏度檢測

提取感染甘薯卷葉病毒（ SPLCV）陽性樣品、番茄黃化卷葉病毒（ TYICD）陽性樣品的總DNA，甘薯羽狀斑駁病毒（ SPFMV）陽性樣品、甘薯G病毒（ SPVG）陽性樣品、甘薯退綠矮化病毒（SPCSV）陽性樣品的cDNA，利用RPA反應(yīng)體系對其進行特異性檢測。對提取感染SPLCV的DNA樣品采用10倍濃度進行稀釋，進行RPA反應(yīng)進行靈敏度檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1甘薯卷葉病毒RPA反應(yīng)體系的建立

設(shè)計了9對甘薯卷葉病毒RPA擴增引物，篩選到1對擴增效果較好的引物SPLCV（ RPA）F和SPLCV（ RPA）R，擴增大小為500 bp左右，和設(shè)計引物片段大小一致，產(chǎn)物經(jīng)過測序，片段大小為464 bp，證明擴增片段為甘薯卷葉病毒的特異序列（圖1）。利用該引物進行RPA程序優(yōu)化，最終為RPA反應(yīng)體系50 uL，模板DNA 2 uL（4 ng·uL-1），RehydrationBuffer 29.5 uL、引物F和R各2.4 uL（0.48 umol·L-l）、ddH20 11.2 uL、醋酸鎂溶液（MgOAc） 2.5 uL（ 280mmol·L-l），50 uL反應(yīng)體系加至凍干酶粉中，39℃反應(yīng)20 min。

2.2甘薯卷葉病毒RPA特異性檢測

用建立的RPA反應(yīng)體系檢測SPLCV、番茄黃化卷葉病毒（ TYLCD）、甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）、甘薯G病毒（ SPVG）和甘薯退綠矮化病毒（SPCSV）。取5 uL產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，具體結(jié)果如圖2所示，只有SPLCV檢測結(jié)果有特異性條帶，其他樣品不產(chǎn)牛特異條帶，說明建立的RPA檢測方法對SPLCV的檢測具有較好的特異性。

2.3甘薯卷葉病毒RPA靈敏度檢測

采用10倍濃度系列稀釋法將提取的甘薯卷葉病毒DNA稀釋成10 ng·uL-l、1 ng·uL-l、100 pg·uL-l、10 Pg·uL-l、1 pg·uL-l、100 fg·uL-1、10 fg·uL-l、1fg·uL-l共8個不同質(zhì)量濃度梯度，進行RPA反應(yīng)。在RPA反應(yīng)結(jié)束后，取5uL擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖3所示：甘薯卷葉病毒RPA靈敏性檢測，瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)RPA特異性帶，檢測靈敏度可達10 pg·uL-l，這與普通PCR靈敏度相當。

3討論與結(jié)論

目前用于甘薯卷葉病毒檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定法、PCR法、QPCR法和LAMP法等，但是，常規(guī)PCR及QPCR檢測技術(shù)需要專業(yè)儀器并由分子生物學(xué)專業(yè)實驗人員操作，檢測時間長，操作復(fù)雜。LAMP恒溫擴增技術(shù)需針對靶基因的6個位點設(shè)計出4條引物，并且在較高的恒溫條件下（ 60～65℃）保溫60～90 min進行反應(yīng)，引物設(shè)計復(fù)雜，擴增時間長，且易出現(xiàn)假陽性等缺點。RPA檢測技術(shù)重組酶聚合酶擴增技術(shù)（ Recombinase polymeraseamplification，RPA）是英國TwistDx公司開發(fā)的一種新型等溫擴增技術(shù)，是DNA診斷領(lǐng)域的革命性突破。該技術(shù)與RT-PCR和QRT-PCR擴增技術(shù)比較，不需要借助昂貴的儀器設(shè)備，具有操作簡便、檢測效率高，只需要在37～42℃的恒溫條件下反應(yīng)20～40 min即可完成檢測任務(wù)。目前該技術(shù)在醫(yī)學(xué)、食品安全檢測和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[14-16]。

本研究根據(jù)甘薯卷葉病毒AV1基因的保守區(qū)段設(shè)計了一對RPA檢測用引物，并對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行優(yōu)化，最終建立了SPLCV的RPA快速檢測方法。本研究建立的RPA檢測方法具有快速、靈敏、特異性強、不需要特殊儀器等優(yōu)點，可用于開發(fā)適合田間甘薯生產(chǎn)中開展實地檢測的快速檢測試劑盒，從而保障甘薯無毒種苗的健康生產(chǎn)。

參考文獻：

[1]CLARK c A HOY M w Effects of common viruses on yield andquality of beauregard sweet potato in Louisiana [J]. Plant Disease.2006. 90 （1）：83-88

[2] LING K s.JACKSON D M.HARRJSON H et al Field evaluation ofVield effects on the USA heirloom sweet potato cultivars infected bvSWeet potato leaf curl virus [J]. Crop Protection，2010，29 （7）：757-765

[3]ZERBINI F M BRIDDON R w IDRIS A，et al ICTV virustaxonomy profile： Geininiviridae [J]. The Journal of GeneralVirology，2017，98 （2）：131-133

[4]劉起麗中國甘薯雙生病毒種類鑒定、分子變異及檢測方法研究[D]北京中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015： 10-14

LIU Q L Identification of species. molecular variation and detectioninethods of sweepoviruses in china[D]. Beijing： China AgriculturalUniversity. 2015： 10—14（m Chinese）

[5]張振臣，馬淮琴，張桂蘭甘薯病毒病研究進展[J]河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000 （9）：1922

ZHANG Z C，MA H Q，ZHANG G L Advances in virus diseases ofsweet potato[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences. 2000 （9） ：19-22 （in Chinese）

[6]劉起麗 .張建新.李學(xué)成 .侵染甘薯 DNA病毒研究進展[J] .植物保護. 2017.43（3）： 36-42

LIU Q L. ZHANG J X. LI X C Advances in research of DNA virusinfecting sweet potato[J]. Plant Protection. 2017. 43 （3） ： 3642.（in Chinese）

[7 ] NOTOMI T， OKAYAMA H. MASUBUCHI H. et al. Loop-mediatedisothennal amplification of DNA [J] . Nucleic Acids Research. 2000.28 （12）： e63.

[8]PIEPENBURG 0. WILLIAMS C H. STEMPLE D L. et al. DNAdetection using recoinbination proteins [J]. PLoS Biology.2006.4 （7）： e204

[9] BOYLE D S. MCNERNEY R. TENG LOW H， et al. Rapid detectionof Mycobacterium tuberculasis by recombinase polymeraseamplification [J] . PLo S One. 2014. 9（8） ： el03091

[IO] DAHER R K. STEWART G. BOISSINOT M. et al Recombinasepolymerase amplification for diagnostic applications [J]. ClinicalChemistry. 2016. 62（7） ： 947-958.

[II] WANG T M. YANG J T. Visual DNA diagnosis of Tomato yellowleaf curl virus with integrated recombinase polymerase amplificationand a gold-nanoparticle probe [J]. Scientific Reports， 2019.9（1）：15146

[12]魏梅生. 田茜.趙文軍.等.番茄細菌性葉斑病RPA檢測技術(shù) [J] .植物保護. 2016. 42 （l） ： 150-153

WEI M S. TIAN Q. ZHAO W J. et al. Rapid detection ofpseudomonas syrmgae pv tomato by RPA method EJl PlantProtection. 2016. 42 （l）：150-153. （ in Chinese）

[13] GLAIS L， JACQUOT E Detection and characterization of viralspeciesisubspecies using isothermal recombinase polymeraseamplification （RPA） assays [J]. Methods Mol Biol. 2015. 1302：207-225 .

[14] CUI J. ZHAO Y N. SUN Y L. et al Detection of Babesia gibsoni indogs by combining recombinase polymerase amplification （RPA） withlateral flow （LF） dipstick [J]. Parositology Research. 2018.117 （12）： 3945-3951.

[15] KERSTING S. RAUSCH V. BIER F F. et al Multiplex isotheimalsolid-phase recombinasepolymerase amplification for the specific andfast DNA-based detection of three bacterial pathogens EJlMicrochimica Acta. 2014. 181 （13/14） ： 1715-1723

[16] FENG X Y. SHEN L B. WANG W Z. et al Development of a reversetranscription-recombinase polymerase amplification assay fordetection of sugarcane vellow leaf virus [J]. Sugar Tech. 2018.20 （6）： 700-707.

（責任編輯：林海清）

收稿日期：2021-0524初稿：2021-0630修改稿

作者簡介：許泳清（ 1980-），女，副研究員，研究方向：薯類作物脫毒培養(yǎng)與病毒檢測（ E-mail： 123071729@qq.com）

*通信作者：邱思鑫（ 1974-），男，博士，研究員，研究方向：植物病理學(xué)（E-mail： qiusixin@faas.cn）

基金項目：福建省科技計劃公益類專項（2020Rl031008）;國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項日（CARS—lO-Bl4）;福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程項日（ zvcxny2021005）：農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展超越“5511”協(xié)調(diào)創(chuàng)新工程項日（KXXYJBG0039）：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新聯(lián)盟專項（CXLM2021001）