路少鵬 岳敏 張欣欣 李丹 王文魁 齊永華

摘要：【目的】克隆構(gòu)建利巴韋林（ RBV）單鏈抗體（scFv）基因，對其理化特xing 進(jìn)行分析并對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，為后期檢測方法的建立及分子改造提供參考依據(jù)。【方法】以分泌利巴韋林抗體的雜交瘤細(xì)胞株總RNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL），然后以柔性連接短肽（Gly4Ser）3為接頭拼接完整的scFv-RB V-利用生物信息學(xué)方法對scFv-RBV的理化性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行預(yù)測分析。【結(jié)果】構(gòu)建的scFv基因編碼240個氨基酸，相對分子質(zhì)量為26 162.27 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為8 57。在二級結(jié)構(gòu)中，p一折疊（3917%）和無規(guī)卷曲（45.41%）占主導(dǎo)地位，a-螺旋（5.42%）和β-轉(zhuǎn)角（10%）相對較少。在三級結(jié)構(gòu)中，VH和VL區(qū)域被Linker相互牽拉靠近，形成典型的口袋樣形狀的空問構(gòu)象，符合單鏈抗體的結(jié)構(gòu)特征，理論上可以與RBV抗原特異性結(jié)合。【結(jié)論】成功構(gòu)建scFv-RBV基因，并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測分析scFv的二級、三級結(jié)構(gòu)，該結(jié)果可為后期進(jìn)行單鏈抗體的表達(dá)、純化及定向進(jìn)化提供理論支撐。

關(guān)鍵詞：利巴韋林（ RBV）;單鏈抗體（scFv）;生物信息學(xué);結(jié)構(gòu)預(yù)測

中圖分類號：S 859.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-03 84（ 2021） 08-0909-08

Construction and Structure of Anti-ribavirin Single-chain Antibody Gene

LU Shaopeng 1.2， YUE Min 2. ZHANG Xinxin 2. LI Dan 2. WANG Wenkui l*， QI Yonghua 2*

（ 1. College of Animal Medicine. Shanxi Agriczdtural University， Taigu， Shanxi 030801 . China; 2. Henan Engineering

Laboratoryfor Molecular Diagnosis of Animal Diseases， Xinxiang University， Xinxiang， Henan

453000. China ）

Abstract： 【Objective】 The ribavirin （RBV） single-chain antibody （scFv） gene was constructed. cloned. andphysiochemically analyzed to establish a model for the detection method development and molecular modification.【Method】 Using the total RNA of the hybridoma cell line secreting RBV antibody as a template， both heavy-chain （ VH） andlight-chain variable （VL） regions of the antibody were amplified by RT-PCR. Then the short peptide （Gly4Ser） 3 wasemployed as the splicing joint to construct the complete scFv-RB V. Bioinformatics methods were applied to predict and analyzethe physiochemical properties， protein structure. and functions of the gene. 【Results】The constructed scFv-RBV encoded240 amino acids with a relative molecular mass of 26.162.27 Da and a theoretical isoelectric point of 8.57. The secondarystructure of the protein consisted of 39.17% p-sheets. 45.41% random coils. 5.42% a-helices， and 10% p-turns. In the tertiarystructure， the VH and VL regions were pulled close by Linker， forming a typical pocket-like spatial configuration that conformsto the structural characteristics of a single-chain antibody. Theoretically， it could bind specifically to RBV antigens.【Conclusion】 The successfully constructed scFv-RBV in this study afforded the utilization of bioinformatics methods topredict and analyze the secondary and tertiary structures of scFv gene paving the way for further studies on the expression，purification， and directed evolution of the single-chain antibodies.

Key words： ribavirin （ RBV） ;

single chain antibody fragment （ scFv） ： bioinformatics;

protein structure

0 引言

【研究意義】利巴韋林（ Ribavirin，RBV）是一種廣譜抗病毒藥物，在畜牧業(yè)中被廣泛用于治療禽流感、口蹄疫、流行性腹瀉、狂犬癥等疾病[1-2]。長期使用或?yàn)E用可導(dǎo)致動物機(jī)體對病毒抵抗力降低，同時也會殘留于動物性食品中，因此，我國禁止在畜禽養(yǎng)殖過程中使用RBV[3-4]。免疫學(xué)檢測技術(shù)作為小分子化合物檢測的主要手段之一，其核心試劑是高適應(yīng)性的檢測抗體。單鏈抗體（ single chain antibodyfragment，scFv）是從單克隆抗體衍生而來的一種基因重組抗體，大小僅有完整抗體的六分之一，但具有與親本抗體完全相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)[5]。通過分子生物學(xué)方法可以將單克隆抗體的VH和VL基因通過柔性連接肽進(jìn)行拼接，拼接而成的重組蛋白具有分子質(zhì)量小、特異性及穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而且可以在分子水平上對其進(jìn)行定向改造，以便提高其親和力和特異性，從而更加便捷高效地為體外快速檢測小分子化合物殘留檢測方法的建立提供所需的核心試劑[6]。生物信息學(xué)作為一門綜合計算機(jī)科學(xué)、信息技術(shù)的學(xué)科之一，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測、藥物設(shè)計等方面發(fā)揮了重要作用[7-8]。采用生物信息學(xué)技術(shù)對單鏈抗體序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能分析，后期通過定向改造有望獲得高親和力和靈敏度的單鏈抗體?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前針對利巴韋林藥物殘留檢測方法主要有高效液相色譜法（ HPLC）、毛細(xì)管電泳法、分光光度法及比色法等，這些方法可有效檢測血清[9]、血漿[10]、紅細(xì)胞[11]、白龍散等中藥散劑[12]中的利巴韋林殘留?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于利用利巴韋林單鏈抗體檢測藥物殘留的相關(guān)報道較少，針對利巴韋林單鏈抗體結(jié)構(gòu)的解析及功能研究的報道更是少之又少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在獲得分泌利巴韋林抗體的雜交瘤細(xì)胞株基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出抗體的VH基因和VL基因，然后拼接成scFv-RBV，進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建。后續(xù)利用生物信息學(xué)方法，預(yù)測分析scFv-RBV的理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)，并利用同源建模模擬其三級結(jié)構(gòu)。該研究結(jié)果可為后期進(jìn)行利巴韋林單鏈抗體的親和力成熟、抗體蛋白表達(dá)及純化提供一定的理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

抗scFv-RBV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株由新鄉(xiāng)學(xué)院動物疫病分子診斷河南省工程實(shí)驗(yàn)室提供;核酸蛋白分析儀購自美國Beckman-Coulter公司;梯度PCR反應(yīng)儀和高速低溫離心機(jī)購白美國Thermo Fisher公司;膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司;總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、HS DNA Polymerase、T4 DNA連接酶及大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞均購白大連Takara公司;限制性內(nèi)切酶ⅣotI和SfiI購白New England Biolabs公司;其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2引物設(shè)計

按照文獻(xiàn)13]設(shè)計擴(kuò)增VH及VL基因的引物，并引入合適的酶切位點(diǎn)SfiI和Not I，Linker選擇較常用的（ Gly4Ser）3形式[14];具體引物序列設(shè)計如表1所示（引物序列由上海生工生物工程有限公司合成）。

1.3雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇

為防止細(xì)胞在活化復(fù)蘇時被污染，迅速從液氮罐中取出本實(shí)驗(yàn)室保存的可分泌利巴韋林抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并迅速置于37℃恒溫水浴鍋中緩慢晃動使其迅速解凍。將解凍后的雜交瘤細(xì)胞用10 mLDMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，1000 r·mm-1離心5min，棄去上清液，保留沉淀。然后重新加入10 mL DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞（5% C02），并隔天對細(xì)胞進(jìn)行傳代以保證細(xì)胞活力。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量生長到8×10 6個·瓶-1，選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞提取總RNA。

1.4總RNA的提取及cDNA的合成

為避免外界環(huán)境污染而降解RNA，因此，在超凈工作臺中按照RNA提取試劑盒說明書提取雜交瘤細(xì)胞總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA（表2）。

1.5 VH和VL基因的擴(kuò)增

以cDNA為模板，表1的VH和VL的上下游引物，利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增抗體的VH和VL基因（表3）。擴(kuò)增結(jié)束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果，然后回收純化符合目的大小片段的VH和VL基因，純化后的產(chǎn)物于20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 scFv-RBV基因的構(gòu)建

分別以VH和VL基因片段為模板，通過重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增VH-1inker和VL-1inker（表4）;擴(kuò)增結(jié)束后，以上述反應(yīng)產(chǎn)物混合液為模板，表1中的VH-1inker-For和VL-1inker-Back為引物，擴(kuò)增scFv-RBV基因（表5），然后使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.7 重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv的構(gòu)建與鑒定

利用SfiI和Ⅳot I內(nèi)切酶將scFv-RBV基因和pCANTAB-5E質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，然后使用T4 DNA連接酶將酶切后的scFv與pCANTAB-5E質(zhì)粒進(jìn)行連接（表6），從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv。采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞，然后均勻涂布到含氨芐青霉素（ AMP）抗性的LB固體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)14-- 16 h。次日挑取3個單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，然后將陽性菌進(jìn)行基因測序。

1.8 scFv-RBV蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用DANMAN軟件將測序得到的scFv-RBV核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，然后使用NCBI分析氨基酸序列的同源性和IgG結(jié)構(gòu)域。采用ExPASyProtParam（ https：//web.expasy.org/protparam/）計算其蛋白分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等參數(shù)[15]，并以SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_au-tomat.pl？page-npsasopma.html）預(yù)測分析scFv-RBV的二級結(jié)構(gòu)。在SWISS-MODEL（ http：//swissmodel.expasy.org/）中輸入scFv-RBV的氨基酸序列，推測scFv-RBV蛋白的三級結(jié)構(gòu)并進(jìn)行同源建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 scFv可變區(qū)基因的擴(kuò)增結(jié)果

按照RNA提取試劑盒說明書提取雜交瘤細(xì)胞總RNA，結(jié)果如圖1所示。RNA的條帶從上到下分別為28、18和5S，電泳條帶無拖尾現(xiàn)象，表明RNA較完整。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，分別擴(kuò)增抗體的VH和VL基因，圖2結(jié)果表明，擴(kuò)增的VH和VL片段大小均在350 bp左右，且擴(kuò)增得到的條帶單一，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv的構(gòu)建及序列鑒定結(jié)果

將VH和VL基因等摩爾濃度混勻，采用重疊延伸PCR構(gòu)建scFv-RBV基因（VH-Linker-VL）。圖3結(jié)果表明，擴(kuò)增的條帶在750 bp左右有明顯的目的條帶。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCANTAB-5E-scFv電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5a感受態(tài)細(xì)胞后，菌液PCR鑒定結(jié)果表明（圖4），在750 bp左右有明顯的目的條帶，初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將陽性菌液送去基因測序，測序結(jié)果正確的菌液加終濃度為40%的甘油進(jìn)行保菌， 80℃保存。

2.3 scFv-RBV氨基酸序列分析

利用DANMAN軟件將測序結(jié)果得到的核苷酸序列翻譯成氨基酸，經(jīng)IMGT劃分得知（圖5），VH和VL序列中均有3個互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）和4個框架區(qū)（ FR），且序列內(nèi)無終止密碼子。其中，VH基因編碼118個氨基酸，位于Linker上游;VL基因編碼107個氨基酸，位于Linker下游。VH和VL依靠Linker（ Gly4Ser）3相連接。

2.4 scFv蛋白理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

2.4.1 scFv-RBV氨基酸序列比對分析結(jié)果 利用NCBI在線分析編碼scFv-RBV基因的氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，scFv存在抗體中的典型可變結(jié)構(gòu)域（ IGV），且符合鼠源單鏈抗體可變區(qū)的所有特征，并與多種數(shù)據(jù)庫中已登錄的鼠源單鏈抗體有較高的同源性。其中，與Ig heavy chainV region（ PRI）-mouse（pirIA47329）同源性高達(dá)70%。

2.4.2 scFv-RBV蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果 利用ExPASy ProtParam對scFv-RBV的理化性質(zhì)分析可知，scFv-RBV編碼240個氨基酸，分子式為Cl l79 Hl 795 N311 0364 S8，原子數(shù)為3657，相對分子質(zhì)量為26406.57 Da，理論等電點(diǎn)（PI）為8.76，不穩(wěn)定系數(shù)為37.79，親水性評估值為0.372，推測該蛋白屬于親水性的穩(wěn)定蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明（圖6），該蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲（45.42%）和β-折疊（39.17%）占主導(dǎo)地位，a-螺旋（5.42%）和β-轉(zhuǎn)角（10%）相對較少。

2.4.3 scFv-RBV蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)同源建模 經(jīng)與PDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，PDB ID 5kov.1所編碼的氨基酸序列與scFv-RBV所編碼的氨基酸序列有較高同源性（68.20%）。運(yùn)用在線T具SWISS- Model進(jìn)行scF-RBV的同源模型構(gòu)建。圖7結(jié)果表明，VH和VL主要由無規(guī)卷曲折疊形成，連接肽Linker使兩者牽拉靠近，形成一個有利于抗原結(jié)合的凹槽結(jié)構(gòu)，理論上具有良好的抗原結(jié)合活性。

3討論

利巴韋林白1972年合成后，在臨床上得到了長期廣泛的應(yīng)用，后因其導(dǎo)致動物中毒、免疫抑制、藥物殘留等危害而被國家禁用[16]。但由于其價格低廉，治療效果好等原因，部分不法分子依然在動物養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用。因此，開發(fā)便捷、高效、靈敏的檢測方法迫在眉睫。在眾多藥物殘留檢測方法中，基于抗原抗體特異性結(jié)合建立的免疫分析法，由于操作簡單、結(jié)果呈現(xiàn)快速、通量高，目前已成為檢測動物源性食品中藥物殘留的重要手段之一，其中抗體是免疫分析法的核心試劑[17。

抗體是免疫診斷方法的基礎(chǔ)，也是病原體檢測的一個重要手段[18]。早在19世紀(jì)末期，KOHLER等[19]便利用基因工程方法制備了單克隆抗體，該制備技術(shù)的出現(xiàn)使規(guī)?；苽涓咛禺愋?、均質(zhì)性抗體成為可能，不僅為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究打開了新世界的大門，同時也為疾病診斷與治療提供新工具。然而由于單克隆抗體制備過程復(fù)雜，且市場價格高昂，在一定程度上限制了其臨床使用。隨著基因工程抗體技術(shù)的不斷發(fā)展，單鏈抗體以單克隆抗體衍生物的身份走進(jìn)人們的視野。與傳統(tǒng)單克隆抗體相比，單鏈抗體不僅保留著與親本抗體相同的特定抗原結(jié)合特性，而且成本低、產(chǎn)率高、易與其他蛋白質(zhì)融合形成有預(yù)期功能的抗體分子，目前已在醫(yī)療診斷、治療和小分子化合物檢測等方面推廣應(yīng)用[20-21]。李彤彤等[22]以抗犬細(xì)小病毒（ CPV）的雜交瘤細(xì)胞株為基礎(chǔ)，構(gòu)建的重組單鏈抗體具有與親本抗體相同的免疫活性，免疫效價為1：20;陳倩等[23]基于呋喃唑酮單鏈抗體建立了呋喃唑酮快速檢測法，相較于親本呋喃唑酮單克隆抗體有更廣的檢測范圍和更高的特異性和穩(wěn)定性，其半數(shù)抑制濃度（ IC50）值為13.01 ng·mL-l，檢出限為1.28 ng·mL-l。此外，伴隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測及理化性質(zhì)的詳細(xì)分析也變得越來越容易。其中，同源建模法是目前用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的常用方法之一，主要是通過與PDB數(shù)據(jù)庫中目前已知序列的X射線晶體衍射做對比，而從中選取與模板具有高度保守性的氨基酸序列來構(gòu)建模型。在對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模時，要求序列的一致性至少大于30%，且序列相似度越高，結(jié)構(gòu)和功能越相似[24]。而基于抗體的氨基酸序列和預(yù)測結(jié)構(gòu)，對一些特定位置的氨基酸進(jìn)行定向突變可用于提高抗體親和力和特異性。張雪等[25]根據(jù)羊口瘡病毒（ ORFV）單克隆抗體構(gòu)建出scFv基因，成功對抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，并進(jìn)一步了解和驗(yàn)證互補(bǔ)決定區(qū)（ CDR）與ORFV的B細(xì)胞抗原表位的特異性結(jié)合的分子識別機(jī)制;曹子健等[26]通過分析構(gòu)建的沙拉沙星單鏈抗體的序列及結(jié)構(gòu)，成功構(gòu)建出抗體的三維模型，并與喹諾酮類藥物進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)色氨酸和酪氨酸是抗體與藥物小分子有相互作用的關(guān)鍵氨基酸;謝三磊等[27]對構(gòu)建的金剛烷胺單鏈抗體進(jìn)行序列分析、模型建立和分子對接后，將關(guān)鍵氨基酸甘氨酸定向突變?yōu)楸奖彼?，抗體的靈敏度較突變前提高了3.9倍;段長飛等[28]從能分泌抗阿莫西林單鏈抗體的雜交瘤細(xì)胞人手構(gòu)建了單鏈抗體，通過采用生物信息學(xué)方法分析抗體序列后，將輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（ CDR） L3的關(guān)鍵氨基酸絲氨酸定向突變?yōu)樘於０泛凸劝彼?，結(jié)果表明較突變前靈敏度分別提高了2.2倍和2.5倍。綜上所述，為進(jìn)一步提高抗體的親和力和靈敏度，可以從生物信息學(xué)方法人手，通過對抗體的序列進(jìn)行分析，然后對抗體進(jìn)行進(jìn)一步的表達(dá)和純化及進(jìn)化。從側(cè)面反應(yīng)生物信息學(xué)的理論和實(shí)驗(yàn)的結(jié)合可以幫助研究者更加深入的了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步明確該抗體的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其生物學(xué)活性奠定了理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

本研究成功構(gòu)建抗scFv-RBV基因。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，scFv基因編碼240個氨基酸，相對分子質(zhì)量為26 406.57 Da，理論等電點(diǎn)（pl）為8.76;在二級結(jié)構(gòu)中，B一折疊（39.17%）和無規(guī)卷曲（45.41%）占主導(dǎo)地位，a-螺旋（5.42%）和β-轉(zhuǎn)角（10%）相對較少。在三級結(jié)構(gòu)中，VH和VL區(qū)域相互牽拉靠近，形成典型的口袋樣形狀的空間構(gòu)象，Linker游離于此結(jié)構(gòu)之外，符合scFv的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，理論上具有良好的抗原結(jié)合活性。該結(jié)果可為后續(xù)進(jìn)行scFv-RBV基因的表達(dá)、純化提供重要的參考依據(jù)，同時也為進(jìn)一步進(jìn)行利巴韋林單鏈抗體的體外進(jìn)化，建立利巴韋林殘留免疫快速檢測方法提供強(qiáng)有力的理論支撐。

致謝：新鄉(xiāng)學(xué)院動物疫病分子診斷河南省工程實(shí)驗(yàn)室提供實(shí)驗(yàn)平臺，鄆東光、潘鵬濤等老師對本研究予以悉心指導(dǎo)，李夢陽、孫夢月、李文明、李紅、張艷芳、蔣力維等同學(xué)給予相關(guān)幫助，謹(jǐn)此致謝！

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（責(zé)任編輯：吳宇琳）

收稿日期：2021-03-10初稿;2021-07-12修改稿

作者簡介：路少鵬（ 1995-），男，碩士研究生，主要從事藥物代謝與藥效研究（E-mail： 130990974l@qq.com）

*通信作者：王文魁（ 1962-），男，博士，教授，主要從事畜禽細(xì)胞因子研究（E-mail： wenkui2009@Veah.net）：齊永華（1977-），男，

博士，教授，主要從事細(xì)菌耐藥性及新藥開發(fā)研究（E-mail： qyh@xxu.educn）

基金項目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項日（ 2018YFCl602900）