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1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 311402 2.寧波市婦女兒童醫(yī)院
烏藥(Linderae Radix)系樟科植物烏藥(Lindera aggregata(Sims) Kosterm.)的干燥根,現(xiàn)主要分布于浙江天臺(tái)、衢州,江西景德鎮(zhèn)、撫州、新余,湖南懷化、邵陽和四川巴中等地區(qū)?,F(xiàn)代藥理研究顯示,烏藥具有調(diào)節(jié)胃腸道功能的作用[1]。天臺(tái)被認(rèn)為是烏藥的道地產(chǎn)區(qū),天臺(tái)烏藥的藥材品質(zhì)和療效與其他產(chǎn)地烏藥相比有著顯著的優(yōu)勢(shì),這種優(yōu)勢(shì)或稱為“道地性”是否與其生長(zhǎng)的地理環(huán)境及由此產(chǎn)生的活性成分差異相關(guān),目前尚未得知。研究表明,產(chǎn)地不同、生長(zhǎng)的環(huán)境存在差異,可引起藥材性狀及所含有效成分的改變,進(jìn)而影響藥材的有效性[2-3]。特征性、指標(biāo)性成分含量的高低是評(píng)價(jià)藥材品質(zhì)好壞的重要標(biāo)準(zhǔn);而藥材的顯微特征觀察示例可用于中藥真?zhèn)舞b定和藥材優(yōu)劣評(píng)價(jià),是道地藥材鑒別的有效方法[4-5]。烏藥醚內(nèi)酯與去甲異波爾定是烏藥的法定檢測(cè)指標(biāo)[6],其中烏藥醚內(nèi)酯亦是其特征性成分[7]。本研究采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC) 法檢測(cè)道地與非道地產(chǎn)區(qū)烏藥去甲異波爾定、烏藥醚內(nèi)酯2個(gè)主要成分的含量并觀察藥材顯微特征,探討地理分布與烏藥藥材“道地性”的相關(guān)性,尋找道地產(chǎn)區(qū)烏藥的獨(dú)特綜合性指標(biāo),擬闡釋烏藥“道地性”的科學(xué)內(nèi)涵[8],為烏藥進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。
1.1 材料 去甲異波爾定對(duì)照品、烏藥醚內(nèi)酯對(duì)照品均購于上海源葉生物科技有限公司 (批號(hào):P10M9L61140、ZJ0630BA14);乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)均購于O-ceanpak公司(批號(hào):20111102G108、20111027G108);甲醇(分析純)、甲酸(分析純)、鹽酸(分析純)均購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號(hào):20200928、20160516、20191216);甲酸(色譜純)購于Aladdin公司(批號(hào):E2022005)。浙江天臺(tái)、湖南懷化產(chǎn)地烏藥藥材由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供,浙江衢州、江西景德鎮(zhèn)、湖北恩施產(chǎn)地烏藥藥材由寧波市鄞州醫(yī)藥藥材有限公司提供,云南楚雄產(chǎn)地烏藥藥材由云南螺螄灣藥材批發(fā)市場(chǎng)采購,天臺(tái)烏藥樣品在產(chǎn)地經(jīng)刮皮處理,余產(chǎn)地樣品為原藥材干燥后所切飲片。
1.2 主要儀器 LC-20A型島津高效液相色譜儀購于日本島津公司;BSA224S型Sartorius電子天平為德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品;XS105DU型電子天平購于瑞士Mettler Toledo公司;SB-5200D超聲波清洗機(jī)購于寧波東南儀器有限公司;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DM500正置顯微鏡為徠卡儀器(德國(guó))有限公司產(chǎn)品。
1.3 烏藥醚內(nèi)酯、去甲異波爾定含量測(cè)定
1.3.1 色譜條件
1.3.1.1 烏藥醚內(nèi)酯含量測(cè)定 Silversil C18柱(4.6nm×250nm,5μm),流動(dòng)相乙腈:水(56:44),柱溫30℃;流速1.0mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)235nm,進(jìn)樣量10μL,理論塔板數(shù)不低于2 000。
1.3.1.2 去甲異波爾定含量測(cè)定 Silversil C18柱(4.6nm×250nm,5μm),流動(dòng)相為乙腈(A):含0.5%甲酸、0.1%三乙胺溶液(B),梯度洗脫(0~13min,10%~22%A,13~22min,22%A),柱溫30℃,流速1.0mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)280nm,進(jìn)樣量10μL,理論塔板數(shù)不低于5 000。
1.3.2 對(duì)照品溶液的制備
1.3.2.1 烏藥醚內(nèi)酯對(duì)照品溶液的制備 精密稱取烏藥醚內(nèi)酯對(duì)照品7mg,稱定質(zhì)量,置于50mL容量瓶中,以甲醇溶解并定容,得0.144mg·mL-1的烏藥醚內(nèi)酯對(duì)照品溶液。
1.3.2.2 去甲異波爾定對(duì)照品溶液的制備 精密稱取去甲異波爾定對(duì)照品11mg,稱定質(zhì)量,置于50mL容量瓶中,以甲醇溶解并定容,得0.220mg·mL-1的去甲異波爾定對(duì)照品溶液。
1.3.3 供試品溶液的制備
1.3.3.1 烏藥醚內(nèi)酯含量測(cè)定供試品溶液制備 精密稱取烏藥粉末0.250g,過3號(hào)篩,置于25mL具塞錐形瓶中,加甲醇至刻度,超聲1h,冷卻,以甲醇補(bǔ)足至刻度線,過0.45μm微孔濾膜,即得烏藥醚內(nèi)酯供試品溶液。
1.3.3.2 去甲異波爾定含量測(cè)定供試品溶液制備 精密稱取烏藥粉末0.100g,過3號(hào)篩,置于具塞錐形瓶中,以移液管移取甲醇-鹽酸(0.5→100)(2:1)25mL,稱定質(zhì)量,加熱回流并保持微沸1h,冷卻,再稱定并補(bǔ)足質(zhì)量,搖勻,取續(xù)濾液,過0.45μm微孔濾膜,即得去甲異波爾定供試品溶液。
1.3.4 精密度考察
1.3.4.1 烏藥醚內(nèi)酯精密度考察 精密稱取同一批次烏藥粉末,按照1.3.3.1項(xiàng)條件提取,1.3.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄各峰面積(mAU×min),計(jì)算6次進(jìn)樣峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)值。
1.3.4.2 去甲異波爾定精密度考察 精密稱取同一批次烏藥粉末,按照1.3.3.2項(xiàng)條件提取,1.3.1.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄各峰面積(mAU×min),計(jì)算6次進(jìn)樣峰面積的RSD值。
1.3.5 穩(wěn)定性考察
1.3.5.1 烏藥醚內(nèi)酯穩(wěn)定性考察 精密稱取同一批次烏藥粉末,按照1.3.3.1項(xiàng)條件提取,1.3.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,分別在0、4、8、12、16、20、24h檢測(cè)并記錄各峰面積(mAU×min),計(jì)算7次進(jìn)樣峰面積的RSD值。
1.3.5.2 去甲異波爾定穩(wěn)定性考察 精密稱取同一批次烏藥粉末,按照1.3.3.2項(xiàng)條件提取,1.3.1.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,分別在0、4、8、12、16、20、24h檢測(cè)并記錄各峰面積(mAU×min),計(jì)算7次進(jìn)樣峰面積的RSD值。
1.3.6 重復(fù)性考察
1.3.6.1 烏藥醚內(nèi)酯重復(fù)性考察 精密稱取同一批次烏藥樣品6份,按照1.3.3.1項(xiàng)條件提取,1.3.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,記錄各峰面積(mAU×min),計(jì)算含量及其RSD值。
1.3.6.2 去甲異波爾定重復(fù)性考察 精密稱取同一批次烏藥樣品6份,按照1.3.3.2項(xiàng)條件提取,1.3.1.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,記錄各峰面積(mAU×min),計(jì)算含量及其RSD值。
1.3.7 線性方程考察
1.3.7.1 烏藥醚內(nèi)酯線性方程考察 精密吸取原濃度的烏藥醚內(nèi)酯對(duì)照品溶液1、2、4、6、10mL至10mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,分別制成濃度為0.0144、0.0288、0.0576、0.0864、0.1440mg·mL-1的對(duì)照品溶液,準(zhǔn)確吸取上述對(duì)照品溶液10μL,按1.3.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)(x,單位mg·mL-1),峰面積為縱坐標(biāo)(y,單位mAU×min),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程。
1.3.7.2 去甲異波爾定線性方程考察 精密吸取原濃度去甲異波爾定對(duì)照品溶液1、2、4、5、10mL至10mL容量瓶中,加甲醇-鹽酸(0.5→100)(2:1)至刻度,搖勻,超聲至完全溶解,分別制成濃度為0.0220、0.0440、0.0880、0.1100、0.2200mg·mL-1的對(duì)照品溶液,準(zhǔn)確吸取上述對(duì)照品溶液10μL,按1.3.1.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。 以濃度為橫坐標(biāo)(x,單位mg·mL-1),峰面積為縱坐標(biāo)(y,單位mAU×min),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程。
1.3.8 加樣回收率考察
1.3.8.1 烏藥醚內(nèi)酯加樣回收率考察 精密稱取已知含量的天臺(tái)烏藥0.125g,加入一定量的烏藥醚內(nèi)酯對(duì)照品,按照1.3.3.1項(xiàng)的方法制備溶液,進(jìn)樣10μL,以1.3.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定峰面積,計(jì)算回收率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。
1.3.8.2 去甲異波爾定加樣回收率考察 精密稱取已知含量的天臺(tái)烏藥0.050g,加入一定量的去甲異波爾定對(duì)照品,按照1.3.3.2項(xiàng)的方法制備溶液,進(jìn)樣10μL,以1.3.1.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定峰面積,計(jì)算回收率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。
1.3.9 含量測(cè)定
1.3.9.1 烏藥醚內(nèi)酯含量測(cè)定 精密稱取6個(gè)不同產(chǎn)地的烏藥0.250g,分別按1.3.3.1項(xiàng)的方法制備供試品溶液,進(jìn)樣10μL,以1.3.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜峰面積,計(jì)算烏藥醚內(nèi)酯含量,重復(fù)2次。
1.3.9.2 去甲異波爾定含量測(cè)定 精密稱取6個(gè)不同產(chǎn)地的烏藥0.100g,分別按1.3.3.2項(xiàng)的方法制備供試品溶液,進(jìn)樣10μL,以1.3.1.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄色譜峰面積,計(jì)算去甲異波爾定含量,重復(fù)2次。
1.4 不同產(chǎn)地烏藥與天臺(tái)烏藥主成分含量差異比較 對(duì)比5個(gè)產(chǎn)地的烏藥中的主成分烏藥醚內(nèi)酯、去甲異波爾定含量,分別按下式計(jì)算相對(duì)天臺(tái)烏藥的含量差異比。含量差異比(%)=(天臺(tái)烏藥主成分含量-其他產(chǎn)地烏藥主成分含量)/天臺(tái)烏藥主成分含量×100%。
1.5 不同產(chǎn)地經(jīng)緯度查詢 通過百度網(wǎng)站查詢,拾取坐標(biāo)系統(tǒng)檢索不同產(chǎn)地的經(jīng)緯度。
1.6 顯微觀察性狀特征 取6個(gè)不同產(chǎn)地的烏藥,打粉過3號(hào)篩,取粉末適量,滴加甘油醋酸進(jìn)行顯微觀察。
2.1 精密度考察結(jié)果 計(jì)算得出,烏藥醚內(nèi)酯、去甲異波爾定RSD值分別為0.68%、0.03%,說明該測(cè)定方法的精密度良好。
2.2 穩(wěn)定性考察結(jié)果 計(jì)算得出,烏藥醚內(nèi)酯、去甲異波爾定RSD值分別為0.36%、0.64%,說明樣品至少在24h內(nèi)穩(wěn)定。
2.3 重復(fù)性考察結(jié)果 計(jì)算得出,烏藥醚內(nèi)酯、去甲異波爾定RSD值分別為0.52%、2.22%,說明該測(cè)定方法的穩(wěn)定性良好。
2.4 線性方程考察結(jié)果 烏藥醚內(nèi)酯在0.0144~0.1440mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=906 471.4612x-1 150.7671(r2=1),去甲異波爾定在0.0220~0.2200mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=12 958 444.1900x+5 552.8778(r2=0.9997),說明該測(cè)定方法線性關(guān)系良好。
2.5 加樣回收率考察結(jié)果 烏藥醚內(nèi)酯回收率RSD值為0.57%,加樣回收率98.70%~100.30%;去甲異波爾定回收率RSD值為2.22%,加樣回收率97.20%~103.90%,說明該方法的加樣回收率符合要求。見表1、2。
表1 烏藥醚內(nèi)酯加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Determination results of the recovery rate of linderane
表2 去甲異波爾定加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Determination results of the recovery rate of norisoboldine
2.6 含量測(cè)定結(jié)果 計(jì)算得出6個(gè)不同產(chǎn)地烏藥中烏藥醚內(nèi)酯、去甲異波爾定的含量,并換算成質(zhì)量分?jǐn)?shù)。見表3。浙江天臺(tái)烏藥中所含烏藥醚內(nèi)酯明顯高于其他產(chǎn)地。各產(chǎn)地烏藥醚內(nèi)酯含量比例為浙江天臺(tái)∶浙江衢州∶湖北恩施∶江西景德鎮(zhèn)∶湖南懷化∶云南楚雄=67∶45∶40∶25∶20∶1, 去甲異波爾定含量比例為浙江天臺(tái):浙江衢州:湖北恩施:江西景德鎮(zhèn):湖南懷化:云南楚雄=62:75:84:65:59:1。
表3 不同產(chǎn)地烏藥主要成分含量測(cè)定及地理分布Tab.3 Assay of main components and geographical distribution of Linderae Radix from different regions
2.7 不同產(chǎn)地烏藥與天臺(tái)烏藥主成分含量差異比較 計(jì)算得出,其他產(chǎn)地相對(duì)天臺(tái)產(chǎn)地的烏藥醚內(nèi)酯含量差異比,浙江衢州、湖北恩施、江西景德鎮(zhèn)、湖南懷化、云南楚雄分別為32.80%、41.50%、62.70%、70.70%、98.50%;而其他產(chǎn)地相對(duì)天臺(tái)產(chǎn)地的去甲異波爾定含量差異比,浙江衢州、湖北恩施、江西景德鎮(zhèn)、湖南懷化、云南楚雄分別為22.00%、35.70%、4.90%、3.60%、98.40%。說明與天臺(tái)比較,各產(chǎn)地所產(chǎn)烏藥的去甲異波爾定含量相對(duì)接近,而烏藥醚內(nèi)酯含量差異比較大,適合作為不同產(chǎn)地品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
2.8 不同產(chǎn)地經(jīng)緯度查詢結(jié)果 浙江天臺(tái)與浙江衢州、江西景德鎮(zhèn)三個(gè)產(chǎn)地經(jīng)度、緯度相近;湖北恩施與湖南懷化兩者經(jīng)度相近;云南楚雄與其他5個(gè)產(chǎn)地經(jīng)度、緯度存在顯著差異。見表3。
2.9 不同產(chǎn)地烏藥性狀特征顯微觀察 顯微觀察各個(gè)產(chǎn)地烏藥粉末顆粒性狀特征提示,浙江天臺(tái)、浙江衢州、江西景德鎮(zhèn)三者顯微特征較相似,淀粉粒、油細(xì)胞常見,浙江天臺(tái)、江西景德鎮(zhèn)未見糊化淀粉粒;湖北恩施與湖南懷化兩者顯微特征較相似,均含有大量糊化淀粉粒,少量石細(xì)胞,較少的油細(xì)胞和淀粉粒,木纖維中淀粉粒較少;云南楚雄與其他5個(gè)產(chǎn)地烏藥顯微差異顯著,其淀粉粒極多,多呈團(tuán)簇狀,木纖維中淀粉粒常見并且顆粒較大,油細(xì)胞較少。見表4及圖1~7。
表4 不同產(chǎn)地烏藥粉末顯微性狀特征Tab.4 Characteristics of microscopic properties of Linderae Radix powder from different regions
圖1 不同產(chǎn)地烏藥淀粉顯微特征(40×)Fig.1 Microstructure of starch granules Linderae Radix from different regions
圖2 不同產(chǎn)地烏藥導(dǎo)管顯微特征(40×)Fig.2 Microstructure of starch catheters of Linderae Radix from different regions
圖3 不同產(chǎn)地烏藥韌皮纖維顯微特征(40×)Fig.3 Microstructure of bast fiber of Linderae Radix from different regions
圖4 不同產(chǎn)地烏藥木纖維顯微特征(40×)Fig.4 Microstructure of wood fibers of Linderae Radix from different regions
圖5 不同產(chǎn)地烏藥油細(xì)胞顯微特征(40×)Fig.5 Microstructure of eleocyte of Linderae Radix from different regions
圖6 不同產(chǎn)地烏藥石細(xì)胞顯微特征(40×)Fig.6 Microstructure of sciereid of Linderae Radix from different regions
圖7 不同產(chǎn)地烏藥糊化淀粉粒顯微特征(40×)Fig.7 Microstructure of Gelatinized starch granules of Linderae Radix from different regions
從主要成分含量檢測(cè)結(jié)果看,本研究提示烏藥地理分布與其“道地性”顯著相關(guān)。浙江天臺(tái)烏藥中烏藥醚內(nèi)酯含量最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.34%,去甲異波爾定含量中等。浙江天臺(tái)與浙江衢州、江西景德鎮(zhèn)三個(gè)產(chǎn)地經(jīng)度、緯度相近,三者主成分含量較相近,其中烏藥醚內(nèi)酯的含量隨著經(jīng)度減小而減少;湖北恩施與湖南懷化兩者雖經(jīng)度相近,但因?yàn)榫暥炔町?,湖南懷化的烏藥醚?nèi)酯含量?jī)H為湖北恩施的一半;云南楚雄與其他5個(gè)產(chǎn)地經(jīng)度、緯度差異均較明顯,成分含量存在明顯的差距。上述結(jié)果提示,產(chǎn)地的緯度、經(jīng)度都能顯著影響藥物主成分的含量,產(chǎn)地經(jīng)緯度與天臺(tái)越接近,烏藥醚內(nèi)酯等主成分含量越道地。黃林芳等[9]對(duì)肉蓯蓉進(jìn)行了生態(tài)研究,發(fā)現(xiàn)不同經(jīng)緯度肉蓯蓉主成分含量存在明顯差異,亦說明地理分布確實(shí)能影響藥材的“道地性”。
從顯微性狀特征看,地理位置分布與烏藥“道地性”亦存在顯著相關(guān)性,產(chǎn)地經(jīng)緯度與天臺(tái)越接近,烏藥顯微特征越道地。浙江天臺(tái)烏藥淀粉粒、油細(xì)胞較多,木纖維中亦含有豐富的淀粉粒,但不含石細(xì)胞;浙江天臺(tái)、浙江衢州、江西景德鎮(zhèn)三個(gè)產(chǎn)地經(jīng)度、緯度明顯相近,三者顯微特征皆較相似,其中淀粉粒個(gè)數(shù)隨著經(jīng)度減小而減少;湖北恩施與湖南懷化兩者經(jīng)度相近,顯微特征比較相似,均含有大量糊化淀粉粒,少量石細(xì)胞,較少的油細(xì)胞和淀粉粒,且木纖維中淀粉粒較少;云南楚雄與其他5個(gè)產(chǎn)地經(jīng)度、緯度相差較大,其所產(chǎn)烏藥顯微差異顯著,其淀粉粒極多,多呈團(tuán)簇狀,木纖維中淀粉粒常見,而且顆粒較大,油細(xì)胞較少,偶見石細(xì)胞。王旭紅等[10]研究認(rèn)為烏藥塊根、直根中無石細(xì)胞;但筆者觀察到了少量石細(xì)胞,與房志堅(jiān)等[11]研究結(jié)論一致。綜上所述,產(chǎn)地經(jīng)緯度對(duì)藥物顯微特征的影響較大,經(jīng)緯度相似的產(chǎn)地所產(chǎn)烏藥的顯微特征相近,經(jīng)度越小淀粉粒越少,石細(xì)胞越多(云南楚雄除外);另外,淀粉粒、糊化淀粉粒和石細(xì)胞可作為不同產(chǎn)地烏藥藥材的顯微鑒別特征指標(biāo)。
研究表明,氣候相似是保障藥材品質(zhì)的基本條件[12]。經(jīng)度、緯度不同直接導(dǎo)致太陽輻射和海陸分布不同,造成不同地段氣候條件的主要因子——光照、溫度、水分等的差異,形成了不同的緯度地帶性和經(jīng)度地帶性氣候環(huán)境,這可能是造成不同產(chǎn)地藥材主成分含量與顯微性狀差異的關(guān)鍵原因,也是造成藥材“道地性”的根本原因。本研究也證實(shí),不同產(chǎn)地經(jīng)緯度不同,所產(chǎn)烏藥主成分含量不同,顯微性狀也存在顯著差異;烏藥品質(zhì)差異與地理分布明顯相關(guān),天臺(tái)特殊的氣候條件造就了天臺(tái)烏藥獨(dú)特的生理生化特征。
綜上所述,本研究結(jié)果提示可將烏藥醚內(nèi)酯含量高,淀粉粒較多、油細(xì)胞較多,不含石細(xì)胞,作為道地烏藥獨(dú)特的綜合性指標(biāo)。另外,依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn):烏藥醚內(nèi)酯不少于0.03%,去甲異波爾定不少于0.40%[6],本研究中云南烏藥所含烏藥醚內(nèi)酯為0.01%,去甲異波爾定為0.01%,不能應(yīng)用于臨床。