杜昊忱，屈玲霞a，郝大偉，楊梅，畢艷艷，關(guān)永霞*，張貴民

1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276006

胡黃連是玄參科植物胡黃連Picrorhiza scrophulariifloraPennell 的干燥根莖，主要分布于我國(guó)西藏、云南和四川的高原地區(qū)，能退虛熱、除疳熱、清濕熱，主要用于骨蒸潮熱、小兒疳熱、濕熱瀉痢、黃疸尿赤、痔瘡腫痛[1]。胡黃連中有效成分主要為環(huán)烯醚萜苷（胡黃連苷）類、葫蘆素類及酚苷類，具有保肝利膽、抗腫瘤、抗糖尿病等多種功效[2]。其中，胡黃連苷類成分可對(duì)抗釋放自由基誘導(dǎo)的肝損傷，并可以改善肝臟中膽固醇的代謝，對(duì)肝臟具有保護(hù)作用[3]。

本課題組通過(guò)硅膠柱色譜分離得到的胡黃連苷為中藥五類新藥，具有清熱利濕、保肝、利膽、降酶的藥理作用，主要用于肝膽濕熱證肝炎或化學(xué)品及藥物毒性造成的肝損害。

現(xiàn)階段，胡黃連提取方法主要有乙醇回流提取法[4]、滲漉法[5]、浸漬法[6]、二氧化碳超臨界萃取法等，多采用正交設(shè)計(jì)法或均勻設(shè)計(jì)法評(píng)價(jià)最佳提取工藝，但這些方法不能在給出的整個(gè)區(qū)域找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式，從而無(wú)法找到整個(gè)區(qū)域中因素的最佳組合和響應(yīng)的最優(yōu)值?？紤]到正交設(shè)計(jì)法和均勻設(shè)計(jì)法的局限性，本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以胡黃連提取物出膏率及胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，用Box-Behnken 響應(yīng)面法[7]對(duì)胡黃連提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀；R2002 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申順生物科技有限公司）；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；XS204型電子分析天平（Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品胡黃連苷Ⅰ（批號(hào)：111727-201702，純度：95.6%）；胡黃連苷Ⅱ（批號(hào)：111596-201805，純度：93.4%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；高效液相色譜用試劑均為色譜純；分析用試劑均為分析純。

胡黃連（產(chǎn)地為西藏自治區(qū)，批號(hào)：190401）經(jīng)中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室范建偉高級(jí)工程師鑒定為玄參科植物胡黃連Picrorhiza scrophulariifloraPennell的干燥根莖。

2 評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定

2.1 出膏率的測(cè)定

精密吸取相當(dāng)于2 g 原藥材量的胡黃連提取液，置已干燥至質(zhì)量恒定（W1）的蒸發(fā)皿中，熱風(fēng)循環(huán)干燥箱中干燥，放置室溫后精密稱質(zhì)量（W2）。

2.2 胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（35.0∶65.0∶0.1）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌愤m量，加甲醇制成含胡黃連苷Ⅰ1.250 mg·mL-1、胡黃連苷Ⅱ3.444 mg·mL-1的溶液，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL 置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密吸取各提取液0.5 mL，置于50 mL量瓶中，精密加甲醇至刻度線，搖勻即得。

2.2.4 胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL 注入色譜儀，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ的峰面積。

2.2.5 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察：精密移取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 倍稀釋，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積值。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并線性回歸，得胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ的回歸方程分別為Y=10 836X+22.585（r=0.999 3），線性范圍0.003 8～0.150 0 mg·mL-1；Y=12 217X+10.21（r=0.999 7），線性范圍0.010 3～0.413 3 mg·mL-1。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算RSD。結(jié)果，胡黃連苷Ⅰ峰面積的RSD 為3.41%，胡黃連苷Ⅱ峰面積的RSD 為2.67%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24、48 h，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算RSD。結(jié)果胡黃連苷Ⅰ峰面積的RSD為2.11%，胡黃連苷Ⅱ峰面積的RSD 為3.27%，表明樣品48 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一供試品溶液6 份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算RSD。結(jié)果，胡黃連苷Ⅰ含量的RSD 為2.76%，胡黃連苷Ⅱ含量的RSD為3.27%，表明該方法的重復(fù)性好。

加樣回收率試驗(yàn)：分別取已知含量的胡黃連提取 液6 份，分別按照1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2 比例加入胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌罚?.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ平均回收率分別為103.98%、101.34%，RSD分別為3.41%、2.75%。

3 單因素考察試驗(yàn)與結(jié)果

單因素考察主要考察提取溶劑、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)，在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將提取溶劑的考察條件定為50%、70%、95%乙醇和水；液料比考察條件定為12∶1、16∶1、20∶1、24∶1；提取時(shí)間考察條件定為1.5、3.0、4.5、6.0 h；提取次數(shù)考察定為1、2、3、4 次。在各項(xiàng)考察條件中選出1 個(gè)最優(yōu)條件作為后續(xù)的提取條件，并為最終的響應(yīng)面優(yōu)化條件提供依據(jù)。

3.1 提取溶劑的單因素考察

取胡黃連粗粉150 g，分別選用50%、70%、95%乙醇和水為提取溶劑，液料比為16∶1，提取時(shí)間為3 h，提取次數(shù)為3 次，合并濾液后回收溶劑得稠膏，備用。按2.1 項(xiàng)下方法進(jìn)行出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率的測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)胡黃連苷提取工藝的影響

由表1 可知，95%乙醇作為提取溶劑，胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率高，故選擇95%乙醇為提取溶劑。

3.2 液料比的單因素考察

取胡黃連粗粉150 g，選用95%乙醇為提取溶劑，液料比考察條件定為12∶1、16∶1、20∶1、24∶1，提取時(shí)間為4.5 h，提取次數(shù)為3 次，合并濾液后回收溶劑得稠膏。按2.1 項(xiàng)下方法進(jìn)行出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 液料比對(duì)胡黃連苷提取工藝的影響

由表2可知，液料比為12∶1、16∶1、20∶1時(shí)，隨著液料比的增加，出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率均增加，當(dāng)液料比為24∶1時(shí)，胡黃連苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率又略下降。因此，選擇液料比為16∶1～24∶1 進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化。

3.3 提取次數(shù)的單因素考察

取胡黃連粗粉150 g，選用95%乙醇為提取溶劑，液料比考察條件定于20∶1，提取時(shí)間為4.5 h，提取次數(shù)分別為1、2、3、4 次，合并濾液后回收溶劑得稠膏，備用。按2.1 項(xiàng)下方法進(jìn)行出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率的測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 提取次數(shù)對(duì)胡黃連苷提取工藝的影響

由表3可知，提取次數(shù)超過(guò)3次時(shí)，胡黃連苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率略微有點(diǎn)下降。因此，選擇提取次數(shù)在2～4 次進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化。

3.4 提取時(shí)間的單因素考察

取胡黃連粗粉150 g，選用95%乙醇為提取溶劑，溶劑用量3.0 L，提取次數(shù)為3 次，提取時(shí)間分別為1.5、3.0、4.5、6.0 h，合并濾液后回收溶劑得稠膏，備用。按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率的測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4 可知，隨著提取時(shí)間的增加出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率均增加，當(dāng)提取時(shí)間為6 h 時(shí)，胡黃連苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率又略下降。因此，選擇提取時(shí)間為3.0～6.0 h進(jìn)行后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化。

表4 提取時(shí)間對(duì)胡黃連苷提取工藝的影響

4 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

4.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，稱取胡黃連粗粉150 g，分別以液料比（A）、提取次數(shù)（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，以出膏率、胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率及綜合得分（R綜）[8]為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，篩選各因素的最優(yōu)條件。胡黃連苷提取工藝綜合評(píng)分指標(biāo)見(jiàn)表5，Box-Behnken響應(yīng)面的因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6，響應(yīng)面二次回歸方程方差結(jié)果分析見(jiàn)表7。

表5 胡黃連苷提取工藝綜合評(píng)分指標(biāo)

利用Design-Expert v 10.0.7 軟件對(duì)表6 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，R綜對(duì)各因素的二次多項(xiàng)回歸模型方程為R綜=-379.49+29.65A+29.07B+51.06C-0.44AB-0.76AC-1.02BC-0.59A2-2.02B2-3.49C2（r=0.977 0）。提示該模型擬合度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。進(jìn)一步對(duì)方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)選胡黃連苷提取工藝設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表7 結(jié)果，對(duì)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)R綜來(lái)說(shuō)，A、B、A2和C2因素均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）；交互項(xiàng)AC 影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；交互項(xiàng)AB和BC的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，失擬項(xiàng)影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示回歸方程擬合度良好。R綜建立的回歸整體模型其P<0.01，達(dá)到極顯著水平。各因素對(duì)R綜值的影響大小順序?yàn)锳>B>C。

表7 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)選胡黃連苷提取工藝二次回歸方程方差分析結(jié)果

4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

利用Design-Expert 10.0.7 軟件得到二次回歸方程的響應(yīng)面圖，以此評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素之間的交互強(qiáng)度，以確定最優(yōu)工藝參數(shù)。見(jiàn)圖1～3。

由圖1 可知，當(dāng)提取次數(shù)一定時(shí)，隨著液料比的增加，R綜逐漸增加，當(dāng)液料比超過(guò)20∶1 時(shí)，R綜開(kāi)始降低；當(dāng)液料比一定時(shí)，隨著提取次數(shù)的增加，R綜逐漸增加，當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)3 次時(shí)，R綜增加緩慢。由圖2 可知，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨著液料比的增加，R綜逐漸增加，當(dāng)液料比超過(guò)20∶1 時(shí)，R綜略微降低；當(dāng)液料比一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，R綜逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)4.5 h 時(shí)，R綜變化不明顯。由圖3 可知，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨著提取次數(shù)的增加，R綜逐漸增加，當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)3次時(shí)，R綜增加緩慢；當(dāng)提取次數(shù)一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，R綜逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)4.5 h 時(shí)，R綜開(kāi)始下降。A 的曲面較陡峭，提示因素A 對(duì)響應(yīng)值影響顯著，其次是B 和C。由等高線圖可知，液料比和提取次數(shù)、提取次數(shù)和提取時(shí)間交互作用的等高線圖沒(méi)有呈現(xiàn)橢圓形，說(shuō)明液料比和提取次數(shù)、提取次數(shù)和提取時(shí)間交互作用不顯著；液料比和提取時(shí)間交互作用的等高線圖呈現(xiàn)明顯的橢圓形，說(shuō)明液料比和提取時(shí)間交互作用顯著。

圖1 提取次數(shù)和料液比對(duì)R綜的響應(yīng)面和等高線圖

圖2 提取時(shí)間和料液比對(duì)R綜的響應(yīng)面和等高線圖

圖3 提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)R綜的響應(yīng)面和等高線圖

經(jīng)Design-Expert 10.0.7 軟件優(yōu)化得到胡黃連總苷類成分的最優(yōu)提取工藝條件液料比為21.23∶1、提取次數(shù)3 次、提取時(shí)間4.61 h。結(jié)合實(shí)際所需，最終確定提取工藝為稱取液料比為20∶1，提取次數(shù)3次，提取時(shí)間4.5 h。

4.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取胡黃連粉末150 g，按優(yōu)化的提取工藝進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到出膏率、胡黃連苷Ⅰ轉(zhuǎn)移率和胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率分別為45.12%、94.15%和91.98%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差分別為0.57%、0.84% 和0.65%，提示優(yōu)化得到的提取工藝穩(wěn)定可靠。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定了提取溶劑，以及液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)三因素的考察范圍。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken 響應(yīng)面法獲得了胡黃連總苷的最優(yōu)提取工藝：95%乙醇提取3 次，液料比為20∶1，提取4.5 h。該方法提取完全、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好，胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ轉(zhuǎn)移率高，可為將來(lái)胡黃連苷進(jìn)一步分離純化提供參考。