宋 杰 郭子雨 姚雨含 李晨陽 趙 軍

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院1，烏魯木齊 830046) (新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室2，烏魯木齊 830004)

睡蓮，多年生水生草本植物，屬睡蓮科(Nymphaeaceae)睡蓮屬植物，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)。該屬植物不僅具有較高的觀賞價值，而且具有較好的食用和藥用價值，其花朵可泡茶，葉柄和花柄可食用。研究顯示睡蓮含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素等多種營養(yǎng)成分，具有美容、降血脂、保肝、增強免疫等生物活性[1-3]。作為一種新型水生蔬菜，近年來睡蓮在我國湖北省仙桃、洪湖及江蘇省宿遷等地進行大量培育、銷售，且每年產(chǎn)值超過1 000萬，取得了很好的經(jīng)濟效益。雪白睡蓮NymphaeacandidaPresl，是一種主要生長在我國新疆伊犁、阿勒泰、博湖等地的睡蓮。該植物的花具有清熱養(yǎng)肝、止咳消炎等功效，在臨床上用于流行性感冒、肝炎等疾病的治療[4-6]。以睡蓮酚isostrictiniin、煙花苷為代表的的多酚類成分是該植物主要特征性成分，該類成分具有較好的抗氧化效果[7]和保肝活性[8]。此外，從可食或藥食同源植物資源中尋找具有顯著抗氧化的食品添加劑越來越受到人們的關(guān)注。因此，本實驗以多酚提取率為指標，通過單因素考察結(jié)合正交設(shè)計優(yōu)化睡蓮多酚的超聲提取工藝，并探討通過大孔樹脂和聚酰胺聯(lián)用純化后睡蓮多酚的抗油脂氧化作用，以期為開發(fā)新型天然抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

睡蓮花：經(jīng)新疆藥物研究所鑒定為睡蓮科睡蓮屬多年生水生草本植物雪白睡蓮NymphaeacandidaC. Presl的干燥花蕾。

睡蓮酚Isostrictiniin對照品(自制，質(zhì)量分數(shù)為 98.7%)；鮮榨葵花籽油和菜籽油；豬油(自制)；抗壞血酸；特丁基對苯二酚(食品級)；檸檬酸；可溶性淀粉；異辛烷、冰乙酸、硫代硫酸鈉等其他試劑均為分析醇。

1.2 實驗儀器

WV-754紫外可見分光光度計，AL204 電子天平，RHP-1000A型高速多功能粉碎機，AS10200ADT超聲玻璃清洗器，XMTD-8222電熱恒溫水浴箱，DUG-9123電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 睡蓮藥材的處理

睡蓮花經(jīng)挑除梗、石子后，粉碎、過40目篩。

1.3.2 標準曲線的繪制

稱取睡蓮酚對照品 10.8 mg，用30%甲醇溶解定容至50 mL的容量瓶中，即得 0.216 mg/mL 的睡蓮酚對照品溶液。精密吸取對照品溶液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分別置于 25 mL容量瓶，并加 30%甲醇稀釋至刻度，搖勻定容后備用。將對照品溶液分別取1.0 mL置于10 mL具塞量筒中，經(jīng)避光處理，加入20%福林酚溶液5.0 mL，混勻反應(yīng)5 min后，再加入7.5%的Na2CO3溶液5 mL后，振蕩搖勻，靜置1 h，在波長765 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。以對照品溶液的濃度為橫坐標(x)，吸光度為縱坐標(y)進行線性回歸，得回歸方程為y=8.333 3x+0.023 9，r=0.999 8；且在 0.017～0.086 mg/mL范圍內(nèi)有著良好的線性關(guān)系。

1.3.3 睡蓮多酚的提取

稱取1.0 g睡蓮花粉末于具塞瓶中，加入一定量的乙醇溶液,置于超聲功率為90 W的超聲儀中，超聲一定時間后，過濾得提取液，將提取液水浴鍋蒸干，真空干燥，即得富含睡蓮酚的提取物，計算出膏率。再稱取干燥的睡蓮提取物11.0 mg，用30%甲醇溶解定容至25 mL的容量瓶中，得待測樣品溶液。精密吸取4.0 mL，用30%的甲醇溶液稀釋定容至25 ml的容量瓶中，然后按標曲繪制方法測定其吸光度，根據(jù)回歸方程計算溶液中睡蓮多酚的質(zhì)量濃度，并計算提取率：提取率= 提取物中睡蓮多酚的含量×出膏率/100%。

1.3.4 睡蓮多酚的提取工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素考察

以睡蓮多酚提取率為指標，分別考察各單因素乙醇體積分數(shù)(10%、30%、50%、70%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃)和超聲時間(20、30、40、50、60 min)對睡蓮多酚提取效果的影響。

1.3.4.2 正交優(yōu)化實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，按照 L9(34) 正交設(shè)計表優(yōu)化睡蓮多酚的提取工藝。以睡蓮多酚提取率為指標，選擇超聲時間、料液比、乙醇體積分數(shù)作為影響睡蓮多酚提取效果的影響因子(見表1)，以此探究最優(yōu)提取條件。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.5 睡蓮多酚的純化

以最優(yōu)條件超聲提取200 g睡蓮花，得到睡蓮多酚提取物。按文獻方法[8]稍加改進進行睡蓮多酚的純化：提取物用適量水溶解，上D101型大孔樹脂柱，先用10倍柱體積的水除雜，再用8倍柱體積的30%乙醇洗脫，減壓濃縮并干燥，得浸膏。浸膏通過30～60目聚酰胺柱進一步純化，用10倍柱體積的水除雜，再用8倍柱體積的70%乙醇洗脫，減壓濃縮并干燥，即得純化后的睡蓮多酚。

1.3.6 睡蓮多酚抗油脂氧化實驗

將睡蓮多酚(終質(zhì)量分數(shù)0.02%、0.04%、0.08%)、TBHQ(終質(zhì)量分數(shù)0.02%)和VC(終質(zhì)量分數(shù)0.02%)分別用0.5 mL的無水乙醇完全溶解，然后分別加入到100.0 g 葵花籽油、菜籽油、豬油中，并以空白油樣作為對照，混合搖晃。避光處理后，置于(60±1) ℃的恒溫烘箱中，每隔12 h振搖1 min，并互相交換位置，每3 d按GB 5009.227—2016的方法，稱取2～3 g的油樣測定各油樣的過氧化值(POV)。同時，按此方法，測定睡蓮多酚與其他抗氧化劑復(fù)配后的抗油脂氧化效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用正交設(shè)計助手Ⅱv3.1進行實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理，并通過Excel繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

如圖1所示，睡蓮多酚提取效果隨乙醇體積分數(shù)的升高而增加，在乙醇體積分數(shù)為50%時提取率可達11.86%，而當繼續(xù)升高乙醇體積分數(shù)，此時將會導(dǎo)致睡蓮多酚提取率下降。以50%乙醇提取，提取率最高，可能是因為在此體積分數(shù)時，睡蓮多酚的溶解性較大，且很容易于從植物組織中釋放。因此選取50%為最佳乙醇體積分數(shù)。

睡蓮多酚提取率隨著料液比的增加逐漸增大，當增加至一定程度(1∶40)時，其提取率將呈現(xiàn)降低趨勢，這可能是由于過高的料液比會增加超聲波破壞植物細胞的阻力，造成睡蓮多酚溶出減少，從而降低了睡蓮多酚的影響效果。因此選擇1∶40 g/mL為最佳料液比。

睡蓮多酚提取率隨著超聲溫度的升高，呈先增加后下降趨勢。這是由于溫度的增加會加快分子的運動速率，有利于提取溶劑進入睡蓮花的組織內(nèi)部，加快睡蓮多酚的溶出。但過高的溫度會使睡蓮多酚的穩(wěn)定性降低，同時也會導(dǎo)致其它溶質(zhì)的溶出，進而使該成分提取效果降低。如圖1所示，當超聲溫度為60 ℃時，睡蓮多酚的提取率最高，故而選取最佳超聲溫度為60 ℃。

超聲提取可加快睡蓮組織中睡蓮多酚的溶出，隨著時間的延長，呈現(xiàn)增大的趨勢。然而，超聲時間越長，相應(yīng)的雜質(zhì)也溶出越多。雜質(zhì)的溶出可導(dǎo)致睡蓮多酚含量的降低，如圖1所示，超聲50 min時，多酚得率達到了11.32%，之后就開始降低。因此選擇50 min為最佳提取時間。

圖1 單因素實驗結(jié)果

2.2 正交實驗優(yōu)化

在表2直觀分析中，R值越大，則該因素對睡蓮多酚提取率的影響越大?？蓪λ彾喾犹崛∮绊懸蛩氐拇笮∵M行由大到小依次排序：B>C>A，即料液比>乙醇體積分數(shù)>提取時間。又由表2可知，處理9(A3B3C2)，即超聲時間為60 min，料液比為 1∶50 g/mL，乙醇體積分數(shù)為50%，睡蓮多酚提取率最高可達15.302 8%；其次為處理3(A1B3C3)，即超聲時間為40 min，料液比為 1∶50 g/mL，乙醇體積分數(shù)為70%，睡蓮多酚提取率達13.232 2%。

由表3方差分析可知，F(xiàn)超聲時間=2.338，F(xiàn)料液比=27.421，F(xiàn)乙醇濃度=3.752。從而可知，料液比(B)對睡蓮多酚提取效果具有顯著性影響(P<0.05)，而超聲時間(A)和乙醇體積分數(shù)(C)均對睡蓮多酚提取效果的影響不顯著(P>0.05)。

根據(jù)表2和表3結(jié)果分析可得，料液比對睡蓮多酚提取率有顯著性影響(P<0.05)，因此可選擇B3；而超聲時間和乙醇體積分數(shù)對睡蓮多酚提取率無顯著性影響(P>0.05)，且根據(jù)k值的大小發(fā)現(xiàn)：A1、A2與A3的均值相差不大，故從時間方面考慮，可選最佳超聲時間為A1，而乙醇濃度C2值最大，故C2為最佳可取值。超聲提取工藝的最優(yōu)條件為A1B3C2，即超聲時間40 min，料液比1∶50，乙醇體積分數(shù)50%為理論超聲提取睡蓮多酚的最佳工藝條件。

表2 超聲提取正交實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 正交實驗方差分析表

2.3 驗證實驗

準確稱取1.0 g睡蓮花粉末3份，按照最佳提取工藝條件提取所得睡蓮多酚提取率分別為14.318%、14.639%、14.297%，平均值為14.418%， RSD為1.33%。該工藝方法合理、穩(wěn)定，具有良好的重現(xiàn)性。

2.4 睡蓮多酚的純化

睡蓮花200 g經(jīng)過大孔樹脂和聚酰胺聯(lián)用純化得到睡蓮多酚15.62 g，其中多酚質(zhì)量分數(shù)為(79.29±0.75)%。

2.5 睡蓮多酚的抗油脂氧化作用

2.5.1 睡蓮多酚對葵花籽油的抗氧化作用

由圖2可知，葵花籽油的過氧化值隨著時間的增加也在不斷的增加，不僅不同組的抗氧化劑對葵花籽油有著不同程度的抗氧化性，而且各實驗組測定的過氧化值均低于空白對照組的。隨著睡蓮多酚劑量的增大，其過氧化值增加的速度下降，當添加0.08%的睡蓮多酚，可發(fā)現(xiàn)其測定的過氧化值與添加0.02%的VC和0.02%的TBHQ值不相上下。因此高劑量0.08%的睡蓮多酚的抗氧化性能較好。

圖2 睡蓮多酚抗葵花籽油過氧化值影響

2.5.2 睡蓮多酚對菜籽油的抗氧化作用

由圖3可知，菜籽油的POV隨加速氧化時間的延長均呈上升趨勢，對照組和各個實驗組均表現(xiàn)出不同的氧化速度。又可由空白對照組的POV明顯高于各個試驗組所測定的POV，表明睡蓮多酚對菜籽油具有良好的抗氧化作用。且其抗氧化效果由強到弱依次為:0.02%VC>0.02%TBHQ>0.08%睡蓮多酚>0.04%睡蓮多酚>0.02%睡蓮多酚。

圖3 睡蓮多酚抗菜籽油過氧化值影響

圖4 睡蓮多酚抗豬油過氧化值影響

2.5.3 睡蓮多酚對豬油的抗氧化作用

由圖4可知，睡蓮多酚對豬油的氧化具有較好的抑制作用。隨著睡蓮多酚的添加量的增大，豬油產(chǎn)生氫過氧化物的能力的下降，表明不同劑量睡蓮多酚對豬油的抗氧化效果存在著正相關(guān)關(guān)系，且0.08%的睡蓮多酚的抑制能力接近于0.02%的VC和0.02%的TBHQ抑制能力。

2.5.4 睡蓮多酚與其他抗氧化劑對豬油的協(xié)同增效作用

分別將0.02%TBHQ+0.02%睡蓮多酚，0.02%VC+0.02%睡蓮多酚這2種復(fù)配物及0.02%VC和0.02%TBHQ加入到 100 g 豬油中，并以豬油作空白對照組，通過烘箱法每3 d測定各油脂的過氧化值，探究睡蓮多酚與其他抗氧化劑復(fù)合對抑制豬油氧化的協(xié)同增效作用。如圖5所示，空白豬油組的過氧化值明顯高于各實驗組的，且在第9天后隨著時間的延長急劇升高。將0.02%TBHQ+0.02%睡蓮多酚，0.02%VC+0.02%睡蓮多酚復(fù)配實驗組的過氧化值分別與0.02%VC和0.02%TBHQ實驗組的過氧化值相比，發(fā)現(xiàn)0.02%VC+0.02%睡蓮多酚復(fù)配實驗組的過氧化值明顯低于0.02%VC實驗組的，而0.02%TBHQ+0.02%睡蓮多酚復(fù)配實驗組的過氧化值與0.02%TBHQ實驗組的過氧化值不相上下。因此，睡蓮多酚與VC抗氧化劑復(fù)配后具有顯著的增效作用。

圖5 睡蓮多酚和不同抗氧化劑復(fù)合抗豬油過氧化值影響

3 結(jié)論

本研究通過單因素考察結(jié)合正交實驗優(yōu)化雪白睡蓮中睡蓮多酚的超聲提取工藝，結(jié)果顯示，睡蓮多酚提取的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分數(shù)50%，料液比1∶50 g/mL，超聲溫度60 ℃，超聲時間40 min，超聲功率90 W，其中料液比影響顯著。油脂抗氧化實驗表明，睡蓮多酚對葵花籽油、菜籽油和豬油均具有一定的抗氧化作用，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。本實驗復(fù)配抗氧化劑對豬油的抗氧化活性均強于0.02%睡蓮多酚的，其中睡蓮多酚+VC的抗氧化活性最佳。因此，睡蓮多酚可作為天然抗氧化劑在油脂抗氧化領(lǐng)域具有較好的開發(fā)潛力。