王康旭 陳二虎 唐培安

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023)

以RNA干擾(RNA interference, RNAi)為代表的基因沉默技術(shù)是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域最重要的革命性成果之一[1]。通過向生物體內(nèi)導(dǎo)入靶向目標(biāo)基因的雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)片段，經(jīng)過細(xì)胞識別和吸收后，在細(xì)胞質(zhì)中dsRNA分子會被 Dicer-2(Dcr2)酶切割成為18～25 bp左右的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，siRNA能夠招募相關(guān)蛋白聚集形成沉默復(fù)合體(RISC)，并通過siRNA序列互補特性引導(dǎo) RISC識別靶 mRNA使之降解，從而實現(xiàn)對目標(biāo)基因的特異性抑制[2]。目前，RNAi技術(shù)被廣泛用于功能基因組學(xué)、疾病治療等領(lǐng)域[3]。與此同時，RNAi也給現(xiàn)代農(nóng)業(yè)帶來了巨大的發(fā)展契機，為作物性狀改良、有害生物防控和糧食儲藏等方面提供了新的研究思路和應(yīng)用策略。

儲糧害蟲嚴(yán)重影響了世界糧食及食品安全。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織計算，在發(fā)達(dá)國家中，因害蟲導(dǎo)致的儲糧損失年均在5%～10%，而在發(fā)展中國家中，這一數(shù)字則高達(dá)30%[4]。而實際上，由于害蟲活動所造成的食品污染、防治成本等因素，使得儲糧害蟲所造成的損害遠(yuǎn)高于目前的統(tǒng)計數(shù)字。

磷化氫熏蒸是目前應(yīng)用最為廣泛的儲糧害蟲防控技術(shù)，然而，由于在儲糧保護(hù)領(lǐng)域長達(dá)60余年的單一使用，越來越多的害蟲種群對磷化氫產(chǎn)生了抗藥性，新型害蟲防治技術(shù)的開發(fā)迫在眉睫[5]。利用RNAi技術(shù)，一方面我們可以篩選并抑制跟害蟲抗藥性產(chǎn)生相關(guān)的關(guān)鍵基因，通過解決抗性問題恢復(fù)害蟲對藥劑的敏感性[6]；另一方面通過RNAi技術(shù)能夠篩選出害蟲防治的靶標(biāo)基因，以dsRNA作為新型核酸農(nóng)藥直接應(yīng)用于害蟲防治。

基于RNAi的害蟲防治技術(shù)具有較高的物種專一性，另外，通過選擇不同的靶標(biāo)基因以及不同的dsRNA片段可以控制抗性害蟲的產(chǎn)生，因此被認(rèn)為具有重要的生產(chǎn)應(yīng)用前景[7]。近年來，多篇綜述從其作用機理、效率影響機制等方面對RNAi技術(shù)在作物害蟲防治領(lǐng)域的研究情況進(jìn)行了系統(tǒng)性的總結(jié)[7-9]。而本文將首次從儲糧害蟲防控的角度，對RNAi技術(shù)的重要進(jìn)展和應(yīng)用前景進(jìn)行概括，期望為未來利用該技術(shù)對儲糧害蟲進(jìn)行生物學(xué)研究以及綠色防治提供參考。

1 RNAi在儲糧害蟲中的研究現(xiàn)狀

總的來說，基于RNAi的害蟲防控就是通過設(shè)計合適的dsRNA序列，使其特異性地靶向害蟲生長發(fā)育過程中的必需基因，在dsRNA進(jìn)入害蟲細(xì)胞后激活RNAi反應(yīng)，從而抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)來降低蟲體的適應(yīng)性甚至產(chǎn)生死亡。2017年，美國環(huán)保署(EPA)批準(zhǔn)了第一個基于RNAi的害蟲防治產(chǎn)品，標(biāo)志著RNAi害蟲防治產(chǎn)品的商品化開端[10]。值得注意的是，儲糧害蟲中的RNAi研究起步較早，尤其是在靶標(biāo)基因篩選、應(yīng)用途徑等方面進(jìn)行了大量的探索，取得了一些重要進(jìn)展。

1.1 RNAi應(yīng)用于鞘翅目儲糧害蟲的可行性情況

鞘翅目是儲糧昆蟲中種類最多、數(shù)量最大的一類害蟲，該類昆蟲不僅能夠直接取食儲藏的糧油食品，還能通過次級代謝物的分泌對儲糧產(chǎn)生間接的危害，同時多種鞘翅目害蟲已經(jīng)對傳統(tǒng)的熏蒸方式產(chǎn)生了較高的抗性，因此，開發(fā)基于RNAi的新型害蟲防治方法對該類害蟲防控的意義重大[4,11,12]。在儲糧昆蟲中，赤擬谷盜是最早使用RNAi進(jìn)行研究的對象，Brown等[13]在赤擬谷盜卵期注射致畸基因Deformed的dsRNA，導(dǎo)致胚胎畸形和死亡，并且隨著赤擬谷盜全基因組的測序，該蟲逐漸作為模式昆蟲被廣泛用于RNAi的研究之中。對于該蟲的研究表明，跟發(fā)育相關(guān)的基因能夠作為潛在的RNAi靶標(biāo)位點用于害蟲防治。例如，Arakane等[14,15]就發(fā)現(xiàn)向赤擬谷盜幼蟲微量注射幾丁質(zhì)去乙?；富?ChitinDeacetylase,CDA)或幾丁質(zhì)合成酶基因(ChitinSynthase,CHS)的dsRNA后，試蟲的幾丁質(zhì)代謝被干擾，死亡率顯著提高。相較于零星的功能基因鑒定，“iBeetle” 項目則利用dsRNA顯微注射技術(shù)在全基因組解析的基礎(chǔ)下對1/3的赤擬谷盜基因(約5000個)進(jìn)行了大面積的功能分析，對每個候選基因沉默后的表型進(jìn)行了統(tǒng)計[16]，在此基礎(chǔ)上，Ulrich等[17]通過分析抑制后出現(xiàn)致死表型的快慢和死亡試蟲比例對致死基因進(jìn)行篩選，挑選出了11個防治赤擬谷盜效率最高的RNAi靶標(biāo)基因(表1)，而這些基因在其他物種中的同源基因同樣表現(xiàn)出了極強的致死效應(yīng)[18]。另外，在赤擬谷盜中的研究還表明，利用RNAi抑制部分細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)能夠使得抗性害蟲恢復(fù)對磷化氫等化學(xué)藥劑的敏感性，為抗性治理提供了新思路[19,20]。

伴隨著RNAi在赤擬谷盜中的大量應(yīng)用，該技術(shù)在其他鞘翅目儲糧害蟲中的效果也逐漸得到了證實。在玉米象(Sitophiluszeamais)中，Vallier等[21]通過dsRNA注射(200 ng/頭)將肽聚糖識別蛋白(Peptidoglycan Recognition Protein)基因的表達(dá)量敲低至對照組的2%，而Huang等[22]利用dsRNA喂食玉米象，抑制了細(xì)胞色素P450相關(guān)基因的表達(dá)，提高了試蟲對松油烯-4-醇的敏感性。在煙草甲中，研究人員通過向初孵幼蟲連續(xù)喂食含有靶向致死基因SNF7或26Sprot的dsRNA溶液，20 d后的試蟲死亡率分別為95%和93%[23]。在銹赤扁谷盜(Cryptolestesferrugineus)中，Zhang等[24]分別通過喂食和注射dsRNA的方式，成功抑制了幾丁質(zhì)合成酶基因CHS2的表達(dá)。另外在藥材甲(Stegobiumpaniceum)中，通過注射靶向幾丁質(zhì)乙?；駽DA1的dsRNA，可以影響試蟲的蛻皮現(xiàn)象，進(jìn)而造成試蟲死亡[25]。

表1 赤擬谷盜RNAi高效致死基因

通過以上研究可以發(fā)現(xiàn)，抑制害蟲生理及生長發(fā)育中關(guān)鍵基因表達(dá)，能夠影響害蟲的生長發(fā)育情況，從而導(dǎo)致害蟲的死亡，這也表明利用RNAi防治鞘翅目儲糧害蟲的可能性高。

1.2 RNAi應(yīng)用于其他儲糧害蟲的可行性情況

除了鞘翅目甲蟲外，還有蜚蠊目、嚙目和鱗翅目中的昆蟲同樣對儲糧造成了嚴(yán)重危害。其中，研究人員利用蜚蠊目害蟲作了大量RNAi相關(guān)工作。Martin等通過向德國小蠊(Blattellagermanica)幼蟲和成蟲注射dsRNA，抑制了核受體基因(RXR/USP)的表達(dá)[26]，從而大大提高了試蟲死亡率；另一個研究中，研究人員向德國小蠊末齡幼蟲注射靶向蛻皮激素受體基因(ecdysonereceptorisoform-A)的dsRNA，導(dǎo)致試蟲出現(xiàn)了發(fā)育遲緩、畸形等現(xiàn)象，最終產(chǎn)生了明顯的防治效果[27]；Lin等[28]則向德國小蠊喂食脂質(zhì)體載體包裹的dsRNA，通過沉默微管蛋白基因(α-tubulin)造成了害蟲死亡。在另一種儲糧中常見的蜚蠊目害蟲美洲大蠊((Periplanetaamericana)中，Wang等[29]利用注射和喂食dsRNA的方式，顯著抑制了美洲大蠊幾丁質(zhì)酶基因(Chitinase)的表達(dá)，抑制效率分別為82%以及47%；另外，我國科學(xué)家還利用RNAi技術(shù)對美洲大蠊全基因組測序后拼接比對的大量基因數(shù)據(jù)進(jìn)行了功能鑒定，對影響該蟲生長發(fā)育、免疫等生理現(xiàn)象的重要基因進(jìn)行了解析，為基于RNAi的防治研究打開了新的思路[30]。

對于鱗翅目儲糧害蟲RNAi研究主要集中在印度谷螟(Plodiainterpunctella)中，F(xiàn)abrick等[31]通過胚胎注射dsRNA的方式成功抑制了色氨酸加氧酶基因(tryptophanoxygenase)的表達(dá)，影響了孵化后幼蟲的眼發(fā)育情況；Siaussat等[31]利用dsRNA注射，成功抑制了蛻皮激素(20-hydroxyecdysone)的生成，引起了下游發(fā)育相關(guān)基因的過量表達(dá)；Han等[32]通過dsRNA注射的方式激活了印度谷螟幼蟲體內(nèi)的RNAi反應(yīng)，有效沉默了胞內(nèi)鈣非依賴型磷脂酶A2(Calcium-independent cellular phospholipase A2)基因的表達(dá)，從而提高了脂質(zhì)過氧化水平，進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)試蟲的抗細(xì)菌免疫能力也受到了顯著的影響。另外，在另一種鱗翅目儲糧害蟲粉斑螟蛾(Cadracautella)中，注射靶向卵黃原蛋白受體基因(vitellogeninreceptor)的dsRNA片段，可以導(dǎo)致成蟲生育力以及幼蟲孵化率的顯著降低，產(chǎn)生了良好的防治效果[31]。

嚙目的書虱類害蟲同樣對糧油食品的安全儲藏造成了嚴(yán)重影響，對于其RNAi的研究發(fā)現(xiàn)，嗜卷書虱(Liposcelisbostrychophila)體內(nèi)酯酶(Esterase)家族的部分基因在喂食dsRNA后能夠得到顯著抑制，進(jìn)一步生測實驗表明，試蟲對馬拉硫磷殺蟲劑的敏感性也得到了明顯的升高，提升了防治效率[33]。

通過以上研究可以發(fā)現(xiàn)，目前在儲糧害蟲中，對于鞘翅目和蜚蠊目昆蟲的RNAi相關(guān)研究較多，但同時發(fā)現(xiàn)，雖然利用RNAi對鱗翅目及書虱類儲糧害蟲進(jìn)行防治具有可行性，但仍需在靶標(biāo)基因、應(yīng)用方式等方面進(jìn)行系統(tǒng)性探索。

2 影響儲糧害蟲RNAi效率的關(guān)鍵因素

RNAi具有極高的序列特異性，因此在具體應(yīng)用過程中能夠?qū)崿F(xiàn)對害蟲的專一性防治，近年的研究也表明，利用RNAi對儲糧害蟲進(jìn)行有效防治的可行性較高，相關(guān)理論研究取得了很大的進(jìn)展。但是，研究結(jié)果同樣表明害蟲的RNAi效率還會受到多種因素的影響。以下，將從昆蟲種類與遞送方式選擇、靶標(biāo)基因與dsRNA分子設(shè)計這兩個方面進(jìn)行重點介紹。

2.1 昆蟲種類與遞送方式影響RNAi效率

注射和喂食體外合成的dsRNA是在儲糧昆蟲學(xué)研究中使用最多的兩種遞送方式[6,34]。然而目前的研究結(jié)果表明，RNAi效率會隨著昆蟲種類和遞送方式的不同而發(fā)生巨大的變化[35]。大部分鱗翅目昆蟲對于dsRNA注射和喂食的敏感性都較低，一般情況下只有進(jìn)行dsRNA大量注射才能實現(xiàn)靶標(biāo)基因的顯著抑制[36]，作者實驗室的研究結(jié)果表明，利用人工飼料混合dsRNA對印度谷螟進(jìn)行連續(xù)性喂食難以產(chǎn)生有效的RNA沉默。然而在德國小蠊和赤擬谷盜中，注射和喂食dsRNA被證明對其不同的靶標(biāo)基因和生命階段都是行之有效的[26,37]。近年來，研究人員針對昆蟲RNAi種間差異開展了一些研究，發(fā)現(xiàn)dsRNA胞外降解、dsRNA細(xì)胞吸收和RNAi核心機制差異可能是導(dǎo)致昆蟲RNAi種間效率差異的關(guān)鍵原因。

Wang等[29]利用包括美洲大蠊在內(nèi)的4種不同害蟲進(jìn)行RNAi效率和降解比較實驗發(fā)現(xiàn)，不同昆蟲血淋巴的dsRNA降解能力是影響注射RNAi效率的重要因素，而腸道dsRNA降解能力是影響喂食RNAi效率的重要因素，昆蟲種間的 RNAi效率差異與其體內(nèi)的dsRNA酶促降解能力密切相關(guān)，這種降解能力決定了昆蟲體內(nèi)靶標(biāo)組織附近的dsRNA暴露劑量從而影響了RNAi效率。在此基礎(chǔ)上，Peng等[38]對不同種類昆蟲的核酸酶生化特性進(jìn)行了分析，然后又通過體外異源表達(dá)、基因沉默對赤擬谷盜體內(nèi)的4種dsRNA酶(TCdsRNase)進(jìn)行了功能鑒定，發(fā)現(xiàn)其中的TCdsRNase-1可能具體參與了外源dsRNA在腸道和血淋巴內(nèi)的降解過程。另外，Guan等[39]發(fā)現(xiàn)了一種僅在幾種鱗翅目昆蟲種特異表達(dá)的核酸酶基因dsREase，通過功能驗證，發(fā)現(xiàn)其能夠快速降解dsRNA，但是目前該酶在鱗翅目儲糧害蟲中的功能尚待解析。

dsRNA只有進(jìn)入細(xì)胞才能發(fā)揮出高效的RNA干擾效率。但是，dsRNA進(jìn)入細(xì)胞涉及到多種機制和影響因素，而這些因素的種間差異都會導(dǎo)致RNAi效率的不同。在線蟲中dsRNA的細(xì)胞吸收主要是通過跨膜通道蛋白SID-1(Systemic RNAi Defective-1)的運輸[40]，而Tomoyasu等[41]發(fā)現(xiàn)沉默赤擬谷盜體內(nèi)SID-1相關(guān)基因并不影響RNAi效率，之后，Xiao等[42]發(fā)現(xiàn)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用可能具體介導(dǎo)了dsRNA進(jìn)入赤擬谷盜細(xì)胞的過程。但是研究人員發(fā)現(xiàn)，胞飲作用、吞噬作用以及SID-1通道蛋白對于其他種類害蟲吸收dsRNA也具有重要的意義[43]。另外，在dsRNA入胞過程中，內(nèi)體逃逸和載脂蛋白同樣影響了dsRNA的內(nèi)化效率。因此，研究代表性儲糧害蟲中的dsRNA吸收機制有助于針對性提高RNAi防治效率。

RNAi 核心機制會影響沉默效率。一方面是核心機制的基因元件組成情況影響了RNAi效率，例如在赤擬谷盜中RNAi核心基因Ago2和R2D2各有兩個同源基因，而在一些RNAi效率較低的昆蟲中則只有一個[41]；同時，Yoon等[44]在赤擬谷盜中鑒定出了鞘翅目特有的StaufenC基因，該基因參與了赤擬谷盜高效RNAi過程。另一方面，核心基因的表達(dá)情況影響了RNAi效率，例如當(dāng) dsRNA被注射進(jìn)入德國小蠊時，關(guān)鍵基因Dcr2能夠在6 h內(nèi)上調(diào) 5 倍，而在多數(shù)RNAi低效昆蟲中則沒有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象[8]。這些因素可能是導(dǎo)致昆蟲種間RNAi效率多樣性的原因之一。

2.2 靶標(biāo)基因與dsRNA分子設(shè)計影響RNAi效率

合適的RNAi靶標(biāo)基因需要具有：1)蛋白產(chǎn)物半衰期較短；2)表達(dá)于dsRNA較易到達(dá)的體內(nèi)位置。例如在赤擬谷盜體內(nèi)，煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors)的穩(wěn)定期大于 2 周，因此很難通過沉默該基因進(jìn)行害蟲防治[45]；另外，昆蟲體內(nèi)的中央神經(jīng)系統(tǒng)和生殖器官有類似于人體內(nèi)血腦屏障的機制，影響了dsRNA體內(nèi)分布[35]。

dsRNA 分子長度和靶向序列位置的選擇是設(shè)計 RNAi 實驗時需要考慮的兩個重要因素。在dsRNA長度選擇上，研究人員發(fā)現(xiàn)RNAi效率同dsRNA長度存在正相關(guān)，例如在赤擬谷盜中，Miller等[37]發(fā)現(xiàn)69-520 bp的dsRNA都能產(chǎn)生顯著的沉默效果，其中長dsRNA激發(fā)的RNAi更明顯；在此基礎(chǔ)上，Wang等[46]發(fā)現(xiàn)不同長度dsRNA在赤擬谷盜中產(chǎn)生的RNAi效率遵循以下規(guī)律：480 bp≈240 bp>120 bp>60 bp>>21 bp，進(jìn)一步研究表明赤擬谷盜RNAi核心機制對不同長度dsRNA的親和力沒有明顯差異；21 bp dsRNA在赤擬谷盜中無法發(fā)揮RNAi作用的原因是細(xì)胞吸收障礙；而導(dǎo)致dsRNA效率出現(xiàn)480 bp ≈ 240 bp>120 bp>60 bp的主要原因，是昆蟲體內(nèi)核酸酶對不同長度dsRNA的降解能力存在差異。對dsRNA靶向序列位置的研究發(fā)現(xiàn)，由同一個目標(biāo)基因設(shè)計的不同位置的dsRNA所產(chǎn)生的基因沉默效果會有一定差異，例如在赤擬谷盜中，dsRNA具有較多的剪切偏好性位點，而在鱗翅目害蟲中具有特定的dsRNA剪切偏好性位點(例如GGU)[47]。所以在RNAi應(yīng)用中要關(guān)注該問題。

3 提高儲糧害蟲RNAi效率的有效方法

提高害蟲 RNAi 敏感性的主要思路在于提高 dsRNA 在昆蟲體內(nèi)的持續(xù)性，增加細(xì)胞吸收能力以及核心元件的工作效率。目前主要有轉(zhuǎn)基因和基因載體兩種方法在昆蟲學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在農(nóng)業(yè)害蟲中，基因載體得到了大量的應(yīng)用，例如He等[48]利用熒光納米載體FNP在亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)中提高了喂食RNAi效率，Zheng等[49]利用多聚物在大豆蚜(Aphisglycines)中實現(xiàn)了dsRNA觸殺效果等。在儲糧害蟲研究過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體、殼聚糖和量子點等基因載體也有助于增加dsRNA在害蟲體內(nèi)的遞送效率。具體來說，Avila等[50]利用支鏈兩親多肽(BAPC)提高了喂食dsRNA在赤擬谷盜體內(nèi)的運輸擴散能力，提高了RNAi效率；在德國小蠊中的研究表明，脂質(zhì)體材料可以保護(hù)dsRNA免遭體液中核酸酶降解，從而實現(xiàn)了100%的致死效率[28]，另外，Huang 等[51]用脂質(zhì)體包被dsRNA的方法，發(fā)現(xiàn)只需要少量dsRNA就能在德國小蠊體內(nèi)實現(xiàn)對靶標(biāo)基因的沉默效果；在鱗翅目儲糧害蟲中，作者以印度谷螟為研究對象發(fā)現(xiàn)單獨喂食dsRNA無法產(chǎn)生有效的基因沉默，但是在利用殼聚糖、量子點CQD和脂質(zhì)體Lipofectamine2000對dsRNA進(jìn)行包裹后，3種載體都能有效提高靶標(biāo)基因的RNAi致死效率，其中CQD的增效最好(圖1)。

注：以不同載體遞送dsEGFP產(chǎn)生的害蟲死亡率(均小于10%)進(jìn)行校正分析；CHI：殼聚糖，CQD：量子點CQD，LIPO：脂質(zhì)體Lipofectamine2000。不同小寫字母表明處理組間存在顯著性差異(P<0.05，Kruskal-Wallis test)。圖1 不同納米載體復(fù)合dsG3PDH喂食的印度谷螟的校正死亡率

但是目前，基因載體在害蟲RNAi中的毒力增效機理尚缺乏深入探究。在今后的研究中，一方面需要對更多的載體材料進(jìn)行測試篩選；另一方面也需要對載體的增效機理進(jìn)行系統(tǒng)性解讀，助力開發(fā)具有靶標(biāo)特性，高效的dsRNA遞送系統(tǒng)。

4 結(jié)論與展望

RNAi具有高效、專一性強等優(yōu)點，因此被廣泛應(yīng)用于儲糧害蟲基因功能鑒定及其防治研究中。目前dsRNA注射和飼喂在多種儲糧害蟲中都取得了明顯的沉默效果，為RNAi技術(shù)應(yīng)用于儲糧害蟲防治提供了理論依據(jù)。然而，目前該技術(shù)在儲糧害蟲防治實踐中還受到RNAi效率的制約，一方面儲糧害蟲種類與dsRNA遞送方式影響了RNAi效率，造成這種現(xiàn)象的原因可能包括：dsRNA胞外降解、dsRNA細(xì)胞吸收和RNAi核心機制差異等。另一方面，靶標(biāo)基因與dsRNA分子設(shè)計同樣也會影響基于RNAi的儲糧害蟲防治效率。包括脂質(zhì)體、量子點和殼聚糖在內(nèi)的多種基因載體可以通過提高dsRNA在害蟲體液中的半衰期和細(xì)胞吸收、擴散效率，從而增強了基因沉默效果。今后的研究中還需要對RNAi靶標(biāo)基因、效率決定機制及相關(guān)增效技術(shù)進(jìn)行更加深入地探索，另外，RNAi應(yīng)用到儲糧害蟲防控中還需要對其安全性以及dsRNA在糧堆中的穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)性評價，從而促進(jìn)RNAi技術(shù)在儲糧害蟲防控中的應(yīng)用實踐。