張 蒙 趙艷艷 魯玉杰 高 晴

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心， 糧食儲(chǔ)藏安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450001)

米象Sitophilusoryzea(Linnaeus)、玉米象SitophiluszeamaisMotschulsky均屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)，為中國糧油儲(chǔ)藏技術(shù)規(guī)范中規(guī)定的主要害蟲[1]。廣泛分布于全世界多個(gè)國家和地區(qū)，在我國亦是分布廣泛且危害嚴(yán)重的儲(chǔ)藏物蛀食性害蟲[2]。

米象可以在田間感染糧食，在經(jīng)收獲入倉的糧食中通常已隱藏卵、幼蟲或蛹期的害蟲，這些隱蔽蟲態(tài)在糧粒內(nèi)取食發(fā)育，影響糧食品質(zhì)，造成儲(chǔ)糧損失及相當(dāng)嚴(yán)重的危害[3]。米象和玉米象同屬象甲科，為近緣種，二者幼蟲和成蟲在外部形態(tài)上極其相似，而且此兩種象蟲的食性、為害方式、越冬場所、上爬假死等生活習(xí)性及影響它們生長發(fā)育和繁殖的溫度、濕度、天敵等生態(tài)因子也很相似，僅靠觀察兩者外部形態(tài)進(jìn)行區(qū)分十分困難[4]。但這兩種害蟲對(duì)殺蟲藥劑的抗藥性有很大的差別，在儲(chǔ)藏物防治上也存在不同的難度，根據(jù)已發(fā)表的研究調(diào)查和報(bào)道，米象已出現(xiàn)較高磷化氫抗性的品系，而玉米象尚未見到有明顯磷化氫抗性的品系[5]，故快速的鑒定米象和玉米象對(duì)采取相應(yīng)的防治措施十分重要。

為了快速準(zhǔn)確的鑒別近緣物種，Tautz等[6]在DNA分類學(xué)(DNA Taxonomy)的基礎(chǔ)上提出DNA條形碼技術(shù)，即利用一段標(biāo)準(zhǔn)基因的序列做標(biāo)記，通過PCR技術(shù)和基因序列分析的分子鑒定技術(shù)來鑒別檢測不同物種和相同物種間不同個(gè)體差異的目的。標(biāo)準(zhǔn)基因序列的選擇既應(yīng)該足夠保守，利用通用引物能夠大量擴(kuò)增，又應(yīng)該有足夠的變異來區(qū)分不同物種DNA序列[7]。線粒體DNA(mtDNA)中的細(xì)胞色素氧化酶I(COI)基因和細(xì)胞色素氧化酶II(COII)基因序列被廣泛用做標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定和分類。陳春生等[8]利用線粒體COI基因基于PCR技術(shù)擴(kuò)增mtCOI基因序列并測序，然后構(gòu)建分子進(jìn)化樹建立了對(duì)鼠類不同物種進(jìn)行快速鑒定和分類的方法。彭居俐等[9]研究了基于線粒體COI基因的4種鲌屬魚類進(jìn)行物種鑒定。王康等[10]基于線粒體COI和COII基因序列差異建立了沙果小食心蟲和梨小食心蟲的分子鑒定方法，解決了快速準(zhǔn)確鑒別這2種食心蟲的難題。倪艷等[11]通過對(duì)6種斑粉蝶的COI和COII基因的部分序列進(jìn)行分析并對(duì)聚類關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果和形態(tài)學(xué)結(jié)果一致并探討了斑粉蝶屬Delias的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。眾多研究都表明利用線粒體COI和COII此兩個(gè)基因序列的差異可對(duì)近緣種進(jìn)行分子鑒定。

本研究從不同地區(qū)的糧食儲(chǔ)備庫采集米象和玉米象試蟲，提取試蟲的基因組DNA，利用PCR擴(kuò)增試蟲的線粒體COI和COII基因序列，將所獲得的基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)和基因序列相似性分析，然后分別計(jì)算基于COI和COII基因序列的玉米象、米象種內(nèi)及種間遺傳距離，并分別構(gòu)建COI和COII基因單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹，以此建立近緣種米象和玉米象的分子鑒定方法，為這2種儲(chǔ)糧害蟲的快速準(zhǔn)確鑒定及預(yù)測預(yù)報(bào)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

本研究所用的米象和玉米象樣本采自于河南鄭州、廣西南寧、山東煙臺(tái)、江蘇通州、四川成都、廣東中山、湖南長沙、北京中糧的某糧庫或加工廠。試蟲樣本均以水分16%的小麥為飼料，在溫度為28～32 ℃、相對(duì)濕度為65%～75% RH的恒溫培養(yǎng)箱中，于黑暗條件下培養(yǎng)，用于形態(tài)學(xué)鑒定和DNA提取。用于研究的試蟲樣本的信息如表1所示。

表1 米象和玉米象試蟲信息

1.2 基因組DNA提取

在采集的樣本中，隨機(jī)挑選米象和玉米象樣本，每個(gè)地理種群選取5頭試蟲用于單頭試蟲DNA的提取。利用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒提取試蟲的基因組DNA，提取方法參考試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行。提取的基因組DNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增及序列測定

根據(jù)已發(fā)表研究，選用和設(shè)計(jì)擴(kuò)增米象和玉米象COI和COII基因的引物。擴(kuò)增米象和玉米象線粒體COI基因的通用引物L(fēng)CO1490/HCO2198[12-14]，分別為：

LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，

HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAATCA；

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的米象和玉米象線粒體COII基因序列，參考已有報(bào)道[15]，并稍作修改，設(shè)計(jì)擴(kuò)增COII基因片段的上下游特異性引物分別為： COIIF-5'-TCTAATAGAACACCTTACCTTA-3'，COIIR-5'-CCACAGATTTCAGAGCATTG-3'。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為25 μL，其中DNA模板4 μL，上游和下游引物各2 μL(10 μM)， 12.5 μL Premix Taq(TaKaRa TaqTM)，加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，退火延伸45 s(COI基因Tm：56 ℃，COII基因Tm：58 ℃)，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后再72 ℃延伸6 min。所有PCR擴(kuò)增獲得的片段，在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將電泳檢測為目的條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，膠回收采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行，具體方法參考試劑盒說明書。最后將純化產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 序列分析

將測序所得的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)搜索，并使用DNAman6.0進(jìn)行序列拼接，將拼接好的序列使用MEGAV7內(nèi)含的ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)；利用DNAsp軟件打開比對(duì)對(duì)齊后的序列，分別獲得COI及COII基因序列的單倍型數(shù)目。利用MEGAV 7.0分別計(jì)算米象和玉米象的COI及COII基因序列的堿基組成(A、T、C、G平均百分含量)，以及各自所含有的C (保守位點(diǎn))、V (變異位點(diǎn))、Pi (簡約信息位點(diǎn))和S (自裔位點(diǎn))以及所占的百分含量(%)，基于Kimura-2-parameter (K2P) 雙參數(shù)模型計(jì)算米象和玉米象兩種象蟲的種內(nèi)及種間遺傳距離，并使用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)各分支置信度(bootstrap)進(jìn)行1 000次的重復(fù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 米象和玉米象線粒體COI和COII基因序列分析

本實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增得到所有米象和玉米象試蟲的線粒體COI和COII基因序列，其中COI基因序列長度為712 bp，COII基因序列長度為546 bp。將所得序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)和相似度分析，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)獲得的米象COI基因和COII基因序列與GenBank中登錄的米象COI基因(登錄號(hào)：GU196317.1)和COII基因(登錄號(hào)：KX190700.1)對(duì)應(yīng)序列的相似性分別為98.87%～99.70%和99.72%～100%；測得玉米象COI基因和COII基因序列與GenBank中登錄的米象COI基因(登錄號(hào)：KU757289.1)和COII基因(登錄號(hào)：KX373614.1)對(duì)應(yīng)序列的相似性分別為98.73%～99.55%和99.46%～100%。

注：白色代表種間變異位點(diǎn),下同。圖1 米象和玉米象COI基因序列比對(duì)

米象和玉米象COI和COII基因序列的比對(duì)結(jié)果分別見圖1和圖2。試蟲樣本共獲得9個(gè)米象的COI基因單倍型(GenBank登錄號(hào)：MT863612、MT863611、MT863610、MT872410、MT872409、MT872406、MT872408、MT872411、MT872405)，這9個(gè)單倍型在10個(gè)堿基位點(diǎn)上具有多態(tài)性，9個(gè)單倍型之間的相似度在98.6% 以上。試蟲樣本共獲得1個(gè)玉米象的COI基因單倍型(GenBank登錄號(hào)：MT863609)。米象和玉米象COI基因種間的相似度在85.84%～86.92%，COI基因在2種象蟲之間存在42個(gè)變異位點(diǎn)(圖1)。

試蟲樣本共獲得3個(gè)米象COII基因單倍型(GenBank登錄號(hào)：MW119321、MW119322、MW119323)，這3個(gè)單倍型在 2個(gè)堿基位點(diǎn)上具有多態(tài)性，9個(gè)單倍型之間的相似度在99.6% 以上。試蟲樣本共獲得8個(gè)玉米象COII基因單倍型(GenBank登錄號(hào)：MW119313、MW119314、MW119315、MW119316、MW119317、MW119318、MW119319、MW119320)，這8個(gè)單倍型在 10個(gè)堿基位點(diǎn)上具有多態(tài)性，8個(gè)單倍型之間的相似度在98.2% 以上。米象和玉米象COII基因種間的相似度在84.47%～87.66%。米象和玉米象COII基因種間的相似度在86.42%～88.14%，COII基因在2種象蟲之間存在21個(gè)變異位點(diǎn)(圖2)。

圖2 米象和玉米象COII基因序列比對(duì)

利用MEGAV7軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析COI和COII基因序列堿基組成。COI基因序列的712個(gè)堿基位點(diǎn)中，C保守位點(diǎn)521個(gè)，比例約為78.46%，COII基因序列的549個(gè)堿基位點(diǎn)中，保守位點(diǎn)457個(gè)，比例約為84.47%；COI基因序列V變異位點(diǎn)142個(gè)，比例約為21.38%，COII基因序列V變異位點(diǎn)84個(gè)，比例約為15.52%；COI基因序列Pi簡約信息位點(diǎn)91個(gè)，比例約為13.70%，COII基因序列Pi簡約信息位點(diǎn)29個(gè)，比例約為5.36%；COI基因序列S自裔位點(diǎn)51個(gè)，比例約為7.68%，COII基因序列S自裔位點(diǎn)55個(gè)，比例約為10.16%；COI基因序列T、C、A、G四種堿基的平均含量為34.30%、19.70%、30.70%、15.30%，A+T的平均含量為65.0%，C+G的平均含量為35.0%。COII基因序列T、C、A、G四種堿基的平均含量為34.50%、9.90%、36.00%、19.60%，A+T的平均含量為70.00%，C+G的平均含量為29.50%，核苷酸堿基構(gòu)成均出現(xiàn)了明顯的A+T含量偏倚現(xiàn)象，此現(xiàn)象皆符合昆蟲線粒體堿基組成的特點(diǎn)[21]。

2.2 遺傳距離

本研究使用MEGAV7軟件基于K2P模型計(jì)算出米象和玉米象的COI基因和COII基因序列間的遺傳距離。由表2可以看出，米象COI基因序列間的遺傳距離在0.002～0.020，相似度為98.0%～99.8%，2種象蟲COI基因種間遺傳距離為0.145～0.162，相似度為93.8%～95.5%，種間遺傳距離顯著高于種內(nèi)遺傳距離(df=43，t=73.534，P<0.001)。

由表3可以看出，玉米象COII基因序列間的遺傳距離在0.001～0.023，相似度為97.77%～99.92%，米象COII基因序列間的遺傳距離在0.011～0.015，相似度為98.37%～98.73%，2種象蟲COII基因種間遺傳距離為0.128～0.154，相似度為86.27%～88.31%，種間遺傳距離顯著高于種內(nèi)遺傳距離(df=53，t=3.925，P<0.001)。

表2 米象和玉米象COI基因單倍型間遺傳距離和相似度

表3 米象和玉米象COII基因單倍型間遺傳距離和相似度

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

以綠豆象CallosobruchuschinensisLinnaeus COI基因序列(GenBank登錄號(hào)：AY625416.1)作外群，將本實(shí)驗(yàn)獲得的9個(gè)米象COI基因單倍型序列和2個(gè)已登錄的米象COI基因序列(GenBank登錄號(hào)：AY131099、GU196318)，以及1個(gè)玉米象COI基因單倍型序列和2個(gè)已登錄的玉米象COI基因序列(GenBank登錄號(hào)：AY131100、MG968936)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果分析顯示(圖3)，米象和玉米象的COI基因單倍型明顯分開，所有的米象COI基因單倍型各自聚在一支。

以綠豆象C.chinensisLinnaeus COII基因序列(GenBank登錄號(hào)：DQ459027.1)作外群，將本實(shí)驗(yàn)獲得的3個(gè)米象和8個(gè)玉米象COII基因單倍型序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果分析顯示(圖4)，所有米象COII基因單倍型聚為一支，所有玉米象COII基因單倍型另外聚為一支。

圖4 基于米象和玉米象COII基因單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹

SZ1和SO1～SO9為本研究獲得的玉米象和米象COI基因單倍型；AY131100和MG968936為GenBank已登錄的相應(yīng)玉米象COI基因序列；AY131099和GU196318為GenBank已登錄的相應(yīng)米象COI基因序列；AY625416.1為GenBank已登錄的相應(yīng)綠豆象COI基因序列SZ1～SZ8和SO1～SO3為本研究獲得的玉米象和米象COII基因單倍型；DQ459027.1為GenBank已登錄的相應(yīng)綠豆象COII基因序列。

3 討論

基于線粒體COI和COII基因擴(kuò)增不同地理種群的米象和玉米象試蟲，獲得多條基因序列，分析得到9個(gè)米象和1個(gè)玉米象的COI單倍型序列，以及3個(gè)米象和8個(gè)玉米象COII單倍型序列，結(jié)果表明，基于線粒體COI和COII基因的米象和玉米象的種內(nèi)遺傳距離均小于0.023，而種間遺傳距離均大于0.128，種內(nèi)距離和種間距離間不存在重疊區(qū)域[16]，并且種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離差異顯著(P< 0.001)。因此，本研究所采用的線粒體COI和COII基因序列可以準(zhǔn)確應(yīng)用于米象和玉米象的近緣種鑒定。

基于PCR技術(shù)的分子鑒定技術(shù)，尤其線粒體COI和COII基因序列目前已廣泛地應(yīng)用到昆蟲近緣種的鑒定中[17-20]。在利用線粒體基因進(jìn)行分子鑒定時(shí)，不同物種間相同的線粒體基因核苷酸序列差異是最重要的標(biāo)準(zhǔn)[21]。Hebert等利用COI基因序列比較分析多種鱗翅目昆蟲后發(fā)現(xiàn)，COI基因核苷酸序列3%的差異可以作為鑒定不同物種的標(biāo)準(zhǔn)，即不同物種COI基因差異大于3%，同一物種COI基因序列差異小于3%，目前大量的相關(guān)研究證實(shí)了這一標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確[22]。

近年來，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，以及PCR技術(shù)的日益成熟，分子生物學(xué)技術(shù)越來越多的用于物種分類和鑒定中，其優(yōu)點(diǎn)是在精細(xì)的分子水平能夠快速、精確的對(duì)物種進(jìn)行分類，尤其是近緣種的快速區(qū)分，但由于這些分子技術(shù)研究的分子標(biāo)記片段單一，因此適用范圍因數(shù)據(jù)庫中參照序列而受限[23]。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定和分類的方法，則需要在識(shí)別和描述形態(tài)外觀和解剖特征上花費(fèi)很多時(shí)間和精力，且此方法極容易受解剖操作及其他因素影響，在鑒定和分類上存在一定的局限[20]。目前，隨著研究方法和技術(shù)的不斷改進(jìn)和更新，利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(COI)序列作為標(biāo)記越來越多的運(yùn)用于不同物種的分子鑒定中，旨在形成一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠及普遍適用的鑒定和分類方法，以滿足不同研究領(lǐng)域和行業(yè)對(duì)于不同物種鑒定和分類的迫切需求。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在6個(gè)地理種群的米象和2個(gè)地理種群的玉米象樣本中，米象、玉米象的COI和COII基因種內(nèi)相似度在97.77% 以上，種間相似度在85.84%～88.31% 之間，且2個(gè)基因的種間遺傳距離顯著高于種內(nèi)遺傳距離，米象、玉米象的COI和COII基因單倍型分別在系統(tǒng)發(fā)育樹上明顯各自聚為一支，同種象蟲的基因序列位于相同的進(jìn)化枝。因此，本研究所采用的線粒體COI和COII基因可以用于近緣種米象和玉米象的分子鑒定。