高品一, 司星星， 張文超， 劉學(xué)貴, 李丹琦

(1.沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142；2.沈陽(yáng)化工大學(xué) 功能分子研究所, 遼寧 沈陽(yáng) 110142；)3.沈陽(yáng)化工大學(xué) 硼鎂資源開(kāi)發(fā)與精細(xì)化工國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽(yáng) 110142；4.沈陽(yáng)化工大學(xué) 遼寧省綠色功能分子設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

金櫻子(RosalaevigataMichx.)為薔薇科薔薇屬植物，又名刺頭、糖鶯子、糖橘子、棠球、燈籠果、藤勾子等，廣泛分布于安徽，兩湖等地[1-3].金櫻子果實(shí)成熟干燥后可入藥，是中國(guó)廣泛使用的傳統(tǒng)民間藥草，具有改善腎臟健康、固精縮尿、澀腸止帶、抑制動(dòng)脈硬化和減少炎癥等作用[4-6].金櫻子果實(shí)中含有多種活性成分，包括三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、酚酸類(lèi)、甾體類(lèi)等化合物，主要活性成分是三萜皂苷類(lèi)，具有抗氧化、抗真菌和降糖降脂等作用[7].金櫻子的果實(shí)還可以用作健康食品和食品添加劑，如滋養(yǎng)口服液、果酒、醋和果醬等[8-10].目前關(guān)于金櫻子活性成分測(cè)定的研究報(bào)道多集中于總黃酮[11]、多糖[12]、總皂苷[13]、兒茶素[14]等.彭焱輝等用分光光度法測(cè)定了金櫻子果實(shí)中總皂苷的含量[13].本文對(duì)金櫻子果實(shí)中兩種三萜化合物皂苷及皂苷元的富集方法進(jìn)行了研究.建立了HPLC法測(cè)定金櫻子果實(shí)中兩種三萜化合物含量的具體方法，為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和有效控制其質(zhì)量提供依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

LC3000型高效液相色譜儀，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；promosil C18高效液相色譜柱，天津博納艾杰爾科技有限公司；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琪有限公司；電子天平BS-224S，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器責(zé)任公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司.

柱層層析硅膠(100～200、200～300、300～400目)，青島海洋化工分廠；HSGF 254硅膠薄層層析硅膠板(20 cm×10 cm)，青島海洋化工分廠；反向高效液相色譜柱，YMC-ODS-A-HG，北京慧得易科技有限責(zé)任公司；二氯甲烷，天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯，石油醚，無(wú)水乙醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑均為分析純，市售.

金櫻子藥材購(gòu)買(mǎi)于沈陽(yáng)市藥材市場(chǎng)，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)路金才教授鑒定為金櫻子RoseLaevigataMichx.的干燥果實(shí)；19α-羥基亞細(xì)亞酸(皂苷元)和19α-羥基亞細(xì)亞-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(皂苷)標(biāo)準(zhǔn)品，沈陽(yáng)化工大學(xué)化工與制藥研究室制備(樣本現(xiàn)保存在沈陽(yáng)化工大學(xué)化工與制藥研究室).

1.2 有效成分的提取

分別稱(chēng)取相同質(zhì)量的金櫻子干燥果實(shí)粉末在相同條件下分別以微波法和超聲波法提取有效成分，處理后注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析.將金櫻子果實(shí)一部分去籽處理按超聲提取條件提取，另一部分不去籽提取，將提取液處理后注入高效液相色譜儀按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定比較兩種化合物含量.

1.3 HPLC測(cè)定條件

色譜柱：promosil C18(4.6 × 250 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫15 ℃；流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)=48∶52，流速0.9 mL/min.進(jìn)樣量：25 μL，面積法計(jì)算含量.

1.4 樣品溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液制備流程：皂苷(19α-羥基亞細(xì)亞-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和皂苷元(19 α-羥基亞細(xì)亞酸)→減壓干燥→分別精密稱(chēng)取5 mg，2.8 mg→無(wú)水甲醇溶解→10 mL容量瓶定容.

樣品溶液制備流程：(1)去籽金櫻子果實(shí)→干燥粉碎過(guò)40目篩→精密稱(chēng)取5 g→V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=5∶1定容于50 mL容量瓶→超聲處理30 min→減壓干燥→甲醇溶解定容于50 mL容量瓶→超聲處理30 min→甲醇定容;(2)未去籽金櫻子果實(shí)→干燥粉碎過(guò)40目篩→精密稱(chēng)取5 g→V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=5∶1定容于50 mL容量瓶→超聲處理30 min→減壓干燥→甲醇溶解定容于50 mL容量瓶→超聲處理30 min→甲醇定容.金櫻子果實(shí)樣品中有效成分的超聲提取條件為：超聲時(shí)間30 min、溫度35 ℃、超聲功率70 W.

2 結(jié)果與討論

2.1 金櫻子皂苷元的提取

采用冷凝回流提取工藝，以體積分?jǐn)?shù)為85 %的乙醇水作為溶劑進(jìn)行提取.14.5 kg干燥粉碎的金櫻子果實(shí)回流提取3次，流動(dòng)相為石油醚，每次60 min；然后將金櫻子果實(shí)晾干，并將其用體積分?jǐn)?shù)為85 %的乙醇水作為溶劑進(jìn)行冷凝回流提取3次，每次2.5 h，并將粗提取液進(jìn)行集中存放；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至一定濃度使用電磁爐繼續(xù)揮發(fā)掉多余的乙醇，得金櫻子濃縮液，將濃縮液繼續(xù)揮發(fā)干溶劑變成浸膏；使用分液漏斗和鐵架臺(tái)對(duì)浸膏進(jìn)行萃取；將適量的浸膏用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入等體積的有機(jī)溶劑二氯甲烷，進(jìn)行反復(fù)萃取(約3次)；萃取完成后得到有機(jī)層二氯甲烷和水層，在水層中加入等體積的乙酸乙酯，進(jìn)行反復(fù)卒取3次；萃取完后得到乙酸乙酯層和水層，萃取后將二氯甲烷層、乙酸乙酯層和水層分別合并.

2.2 金櫻子皂苷元的純化富集

取萃取后的二氯甲烷層樣品與100～200目硅膠(拌樣質(zhì)量比為1∶3)在研缽中充分拌樣；準(zhǔn)備硅膠柱固體相，上樣，洗脫(流動(dòng)相二氯甲烷和無(wú)水甲醇體積比分別為30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1，每組流動(dòng)相沖洗5次);通過(guò)TLC檢測(cè)進(jìn)行相同組分的合瓶.

將富集的減壓開(kāi)放硅膠樣品以拌樣質(zhì)量比為1∶3在研缽中充分拌樣；上樣，將拌好的樣品置于硅膠柱固體相上均勻平整分布，樣高約1.5 cm，然后將200～300目的硅膠裝入1 cm左右的玻璃柱中，放入適量棉花；以二氯甲烷和無(wú)水甲醇體積比為12∶1為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，洗脫到最后一瓶用TLC檢測(cè)無(wú)樣品為止；通過(guò)TLC檢測(cè)進(jìn)行相同組分的合瓶.將富集到的樣品用適量無(wú)水甲醇進(jìn)行溶解，然后上樣在ODS柱上，將其掛樣一夜，用體積分?jǐn)?shù)50 %，55 %，60 %和70 %的甲醇水為流動(dòng)相對(duì)其進(jìn)行洗脫，每個(gè)梯度洗脫5次；通過(guò)TLC檢測(cè)進(jìn)行相同組分的合瓶.經(jīng)過(guò)ODS純化后得到金櫻子皂苷元純品1.5 g，HPLC(液相條件見(jiàn)1.3) 純度均大于95 %.

2.3 金櫻子皂苷元鑒定

將實(shí)驗(yàn)得到的白色無(wú)定形粉末進(jìn)行質(zhì)譜和核磁譜分析.ESI- MS(m/z):527[M+Na]+.1H-NMR(600 MHz,C5D5N)，δ:5.55(1H,br s,H-12),4.23(1H,dt,J=9.6,4.2 Hz,H-2),4.17(1H,d,J=10.8 Hz,H2-23),4.15(1H,d,J=10.8 Hz,H2-23),3.69(1H,d,J=9.6 Hz,H-3)，3.06(1H,dt,J=8.4,2.4 Hz,H-16),3.01(1H,s,H-18),1.62(3H,s),1.48(3H,s),1.10(3H),1.09(3H,d,J=6.4 Hz),1.07(3H,s),1.04(3H,s).13C-NMR(150 MHz,C5D5N),δ:47.8(C-1),68.8(C-2),78.3(C-3),42.1(C-4),47.9(C-5),18.6(C-6),33.1(C-7),40.4(C-8),47.8(C-9),38.3(C-10),24.1(C-11),127.9(C-12),139.9(C-13),42.1(C-14),29.2(C-15),26.3(C-16),48.3(C-17),54.5(C-18),72.6(C-19),42.3(C-20),26.9(C-21),38.3(C-22),66.5(C-23),14.3(C-24),16.7(C-25),17.2(C-26),24.6(C-27),180.6(C-28),27.0(C-29),17.3(C-30).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，表明化合物是金櫻子皂苷元.

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取過(guò)濾后的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液5、10、15、20、25、30、40 μL，按給定色譜條件測(cè)定，以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖1所示.由圖1可以看出：皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5868.69x+6.655 8，R=0.997 0；皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9945.21x-0.902 56，R=0.996 9.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明皂苷和皂苷元含量在0.002～0.03 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系很好，適合作含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

圖1 皂苷和皂苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，在1.3給定色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)得皂苷和皂苷元的峰面積分別為39.169 3，29.118 7；39.457 9，29.688 1；39.604 7，29.552 9；39.682 5，29.616 8；39.145 4，29.109 4.皂苷峰面積的RSD為0.62 %，皂苷元峰面積的RSD為0.95 %，說(shuō)明儀器系統(tǒng)及進(jìn)樣方法精密度很好.

2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一金櫻子干燥粉末3份，按樣品溶液制備流程制備樣品溶液，每份精密吸取25 μL，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾的樣品溶液按照1.3給定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積.經(jīng)計(jì)算總樣中皂苷和皂苷元峰面積的RSD分別為2.5 %和1.4 %，該結(jié)果說(shuō)明此方法的重現(xiàn)性良好.

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一份經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾的金櫻子樣品溶液25 μL，分別于0、3、6、9和12 h注入高效液相色譜儀進(jìn)樣，按照1.3給定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積.比較所得到的5組峰面積，結(jié)果表明在12 h內(nèi)進(jìn)樣時(shí)，總樣中的皂苷及皂苷元等其他組分的檢測(cè)峰型穩(wěn)定性很好.

2.8 加樣回收率的計(jì)算

取3份已測(cè)定2種化合物含量的去籽金櫻子干燥果實(shí)粉末各5 g，分別精密稱(chēng)量3.2 mg、3.19 mg、3.2 mg皂苷和3.4 mg、3.39 mg、3.38 mg皂苷元標(biāo)準(zhǔn)樣品平行加入3份金櫻子中，按照上述標(biāo)準(zhǔn)樣品制備方法制備待測(cè)溶液，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后按1.3給定的色譜條件注入高效液相色譜儀中測(cè)定其峰面積，依據(jù)峰面積計(jì)算每份皂苷和皂苷元的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果如表1所示.

表1 金櫻子中皂苷和皂苷元的加樣回收率

由表1可以看出：皂苷和皂苷元的加樣回收率分別為101.56 %和102.94 %，此結(jié)果說(shuō)明HPLC方法的重現(xiàn)性及準(zhǔn)確度很好.

2.9 樣品含量測(cè)定

分別精密稱(chēng)取3份去籽金櫻子干燥果實(shí)粉末、3份未去籽金櫻子干燥果實(shí)粉末各5 g.按樣品溶液制備方法制備樣品溶液，按1.3給定色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算皂苷和皂苷元的含量結(jié)果見(jiàn)表2和表3.表2、表3結(jié)果表明：去籽金櫻子干燥果實(shí)中的皂苷和皂苷元含量高于未去籽金櫻子干燥果實(shí)，去籽后的平均含量皂苷為10.37 mg/g、皂苷元為5.36 mg/g，而未去籽金櫻子干燥果實(shí)的平均含量皂苷為8.39 mg/g、皂苷元為4.60 mg/g，建議提取兩類(lèi)成分時(shí)將籽去掉以提高得率.

表2 去籽金櫻子果實(shí)中皂苷和皂苷元含量

表3 未去籽金櫻子果實(shí)中皂苷和皂苷元含量

3 結(jié) 論

隨著科技的不斷提高和創(chuàng)新，HPLC的應(yīng)用也逐漸廣泛，并逐漸成為藥物分析的主要技術(shù)手段.HPLC法使用高效固定相，流動(dòng)相采用高壓泵輸送，在線進(jìn)行檢測(cè)，具有分離效能高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、流出組分容易收集等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于藥物的含量測(cè)定.文章成功建立了同時(shí)測(cè)定金櫻子中皂苷(19α-羥基亞細(xì)亞-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和皂苷元(19α-羥基亞細(xì)亞酸)的高效液相色譜測(cè)定方法，面積歸一化法計(jì)算化合物含量，測(cè)得皂苷最多為10.37 mg/g、皂苷元為5.36 mg/g.提取金櫻子有效成分過(guò)程中考察了微波助提和超聲輔助提取兩種方法，文獻(xiàn)記載微波助提有很高的得率，但其選擇性強(qiáng)，對(duì)于同時(shí)多的提取兩種極性的成分結(jié)果不理想，因此以超聲法提取.為使總樣中的兩種成分盡可能多的被提取出來(lái)，并考慮兩種化合物的極性，先以二氯甲烷甲醇液提取，再以甲醇為溶劑提取，結(jié)果中總樣含量均很高.在提取過(guò)程中還考察了金櫻子果實(shí)去籽與未去籽時(shí)兩種成分的含量，結(jié)果表明去籽后皂苷及皂苷元的含量明顯高于去籽前的，說(shuō)明兩種成分主要集中在金櫻子果皮中.該法可以用于金櫻子的質(zhì)量控制.