李靚，朱涵彬，李長(zhǎng)濱，潘春梅，岳曉禹，鄧真真

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450046)

近幾年來(lái)，現(xiàn)代食品工業(yè)對(duì)色素的需求越來(lái)越大，人工合成色素具有著色力強(qiáng)、色澤亮麗等優(yōu)點(diǎn)，但會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏、腹瀉、致癌等健康問(wèn)題[1-2]，早已被大眾棄用，天然色素的安全系數(shù)高，成為未來(lái)主流發(fā)展趨勢(shì)已不可逆轉(zhuǎn)[3-4]。柑橘在中國(guó)的種植范圍較廣、資源豐富[5]，常以鮮果果肉食用，橘皮大多被丟棄，忽略其二次利用價(jià)值。橘皮中含有豐富的天然色素、多酚類[6-7]、黃酮類[8-9]、果膠類[10]等生物活性因子，尤其是橘皮中的黃色素，作為天然色素的一種，作為食品添加劑使用量越來(lái)越多[11]。隨著人們?cè)絹?lái)越注重食品的食用安全，渴望健康綠色的生活，又因橘皮黃色素良好的著色功能、獨(dú)特的保健功能，如抗氧化[12]、防衰老、調(diào)節(jié)免疫力、減脂[13]、減少心血管疾病發(fā)生[14]等功效，在生物、醫(yī)藥[15]等其他領(lǐng)域的應(yīng)用也較為廣闊。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于黃色素的提取進(jìn)行了較多研究，大多使用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，操作過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低[16]。超聲波輔助提取法[17-18]簡(jiǎn)單快捷，提取率也比傳統(tǒng)的提取法大大提高，在工業(yè)推廣方面得到了廣泛的應(yīng)用。為了研究橘皮黃色素，高效的提取率顯得尤為重要，本文擬利用超聲波法輔助提取橘皮黃色素，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提高橘皮黃色素提取率，為橘皮黃色素的研究提供了有效的理論依據(jù)，為新功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮柑橘：購(gòu)于鄭州市永輝超市；無(wú)水乙醇(分析純)：蘇州辰澤化工有限公司；石油醚(分析純)：南京化學(xué)工業(yè)園區(qū)；丙酮(分析純)：天津富宇精細(xì)化工有限公司；乙酸乙酯(分析純)：上海德榜化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

鼓風(fēng)干燥箱 上?；厶﹥x器制造有限公司；高速粉碎機(jī) 浙江榮浩工貿(mào)有限公司；電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗器 昆明市超聲儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵 上海予申儀器有限公司；紫外分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器股份有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橘皮的預(yù)處理

將新鮮的橘皮梗去掉并清洗干凈放在干燥的托盤(pán)上，在干燥箱溫度達(dá)到60 ℃時(shí)放入橘皮開(kāi)始干燥，6 h后取出在高速粉碎機(jī)中立即粉碎。壓碎后的橘皮粉末通過(guò)40目篩后，放入真空袋中，置于陰涼干燥處備用。

1.3.2 黃色素提取溶劑的選擇

稱取橘皮粉末1.00 g于5個(gè)250 mL錐形瓶中，依次滴加蒸餾水、無(wú)水乙醇、石油醚、丙酮和乙酸乙酯各10 mL，在200 W的超聲功率下處理15 min，抽取濾液1 mL定容于25 mL容量瓶中并作空白對(duì)照，在190～540 nm處進(jìn)行紫外光光譜掃描，確定并分析每種溶劑下的最佳吸收波長(zhǎng)，從而得到最合適的提取劑。

1.3.3 單因素試驗(yàn)條件設(shè)計(jì)

設(shè)置料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、超聲時(shí)間(10，15，20，25，30 min)、超聲溫度(40，50，60，70，80 ℃)中3個(gè)因素固定的情況下，另1個(gè)因素的變化趨勢(shì)對(duì)提取黃色素的影響，探究最優(yōu)因素條件。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)分析單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)，選取料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、超聲時(shí)間(C)、和超聲溫度(D)4個(gè)因素為響應(yīng)變量，以吸光度為響應(yīng)值進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Design Expert 8.0.6軟件，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 The factors and levels of response surface experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 黃色素提取溶劑的選擇結(jié)果

通過(guò)分析不同提取溶劑提取液的光譜掃描圖見(jiàn)圖1，得到黃色素的最大吸收波長(zhǎng)在350 nm左右。丙酮、無(wú)水乙醇、蒸餾水和乙酸乙酯的提取效果都比較顯著，但是蒸餾水中所含成分較多，不適用于工業(yè)生產(chǎn)中黃色素的分離與提純，丙酮和石油醚屬于極易揮發(fā)的化學(xué)試劑且石油醚遇明火時(shí)會(huì)發(fā)生爆炸，而乙酸乙酯的價(jià)格比較昂貴，并有刺激性氣味，而無(wú)水乙醇具有價(jià)格低廉、方便回收等優(yōu)點(diǎn)。綜合對(duì)比分析，本試驗(yàn)選取無(wú)水乙醇為提取劑，通過(guò)選取該提取劑光譜掃描得到最大吸收波長(zhǎng)348 nm，對(duì)該試驗(yàn)進(jìn)行吸光度測(cè)定。

圖1 不同提取溶劑的光譜掃描圖Fig.1 Spectral scanning of different extraction solvents

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)黃色素提取液吸光值的影響

稱取5份1.00 g橘皮粉末，按料液比(橘皮粉末和乙醇)為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25準(zhǔn)確稱量無(wú)水乙醇，在溫度為40 ℃、超聲功率為200 W的超聲波儀中超聲處理15 min，抽取1 mL濾液定容到25 mL的容量瓶中并作為空白對(duì)照，測(cè)定3次取其平均值，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同料液比對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of different solid-liquid ratios on the extraction effect

由圖2可知，料液比在1∶10之前，隨著料液比的增加，吸光度值也增加；當(dāng)料液比達(dá)到1∶10時(shí)，黃色素的提取液吸光度值達(dá)到最大，效果最佳；此后繼續(xù)增加料液比，吸光度值呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此，最佳料液比為1∶10 (g/mL)。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃色素提取液吸光度的影響

稱取5份1.00 g橘皮粉末，按乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%和90%準(zhǔn)確稱量，在溫度為40 ℃、超聲功率為200 W的超聲波儀中超聲處理15 min，抽取1 mL濾液定容到25 mL的容量瓶中并作為空白對(duì)照，測(cè)定3次取其平均值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of different ethanol volume fractions on the extraction effect

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于70%時(shí)，吸光度值隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，橘皮黃色素提取液的吸光度最大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，吸光度值反而減少。因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)黃色素提取液吸光度的影響

稱取5份1.00 g橘皮粉末，按超聲時(shí)間為10，15，20，25，30 min進(jìn)行操作，在溫度為40 ℃、超聲功率為200 W的超聲波儀中超聲，抽取1 mL濾液定容到25 mL的容量瓶中并作為空白對(duì)照，測(cè)定3次取其平均值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic time on the extraction effect

由圖4可知，在超聲時(shí)間小于15 min時(shí)，橘皮黃色素提取液的吸光度值最大。當(dāng)超聲時(shí)間在10～15 min內(nèi)，吸光度值隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)也在逐漸增大，黃色素的濃度不斷升高，但大于15 min，黃色素的吸光度值反而呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。因此，可以判定超聲時(shí)間15 min時(shí)提取效果最好。

2.2.4 超聲溫度對(duì)黃色素提取液吸光度的影響

稱取5份1.00 g橘皮粉末，按超聲溫度為40，50，60，70，80 ℃進(jìn)行操作，在超聲功率為200 W的超聲波儀中超聲15 min，抽取1 mL濾液定容到25 mL的容量瓶中并作為空白對(duì)照，測(cè)定3次取其平均值，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，提取液的吸光度值隨著溫度的升高而緩慢上升，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)繼續(xù)升高溫度則吸光度值呈緩慢下降趨勢(shì)，可能是溫度過(guò)高導(dǎo)致了部分黃色素的分解，所以綜合各方面來(lái)看，當(dāng)提取溫度為70 ℃時(shí)提取效果最好。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)和結(jié)果

通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，本試驗(yàn)選擇料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、超聲時(shí)間(C)和超聲溫度(D)作為響應(yīng)因素，以提取液的吸光度作為響應(yīng)值，進(jìn)行橘皮黃色素提取的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface analysis design and experimental results

2.3.2 響應(yīng)面模型的方差分析

響應(yīng)面二次回歸方程方差分析的結(jié)果見(jiàn)表3，表3中料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度的P值均小于0.01，均達(dá)到極顯著水平。應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到4個(gè)變量的二次回歸方程為：

Y=0.76-0.013A+0.017B+0.038C+0.031D-2.25×10-3AB-8.50×10-3AC+3.75×10-3AD-1.25×10-3BC+5.00×10-4BD+4.50×10-3CD-0.023A2-0.020B2-0.044C2-0.018D2。

式中：A代表料液比，B代表乙醇體積分?jǐn)?shù)，C代表超聲時(shí)間，D代表超聲溫度。

表3 二次回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for quadratic regression equation

續(xù) 表

該方程的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9685，即擬合出來(lái)的理論值與96.85%的實(shí)際數(shù)據(jù)是相對(duì)應(yīng)的。由表3可知，本試驗(yàn)失擬項(xiàng)并不顯著(P值>F值=0.1909>0.05，說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合是合適的；且回歸方差模型較為顯著，P值>F值<0.0001。綜合分析可以得出該響應(yīng)面試驗(yàn)是有效可行的，且誤差較小。接下來(lái)對(duì)軟件處理出來(lái)的結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性的檢測(cè)。

2.3.3 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

通過(guò)三維圖能較為全面地凸顯各影響因子間的交互作用并研究其相互影響力大小。其中三維圖中呈現(xiàn)了各影響因子間在變化過(guò)程中響應(yīng)值的變化狀態(tài)，若圖中曲面波動(dòng)幅度較小則說(shuō)明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響較小，反之若波動(dòng)幅度大則影響較大。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)吸光度的影響Fig.6 Effect of ethanol volume fraction and solid-liquid ratio on absorbance

由圖6可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時(shí)，隨著料液比的增加，吸光度值發(fā)生了先上升后下降的變化；當(dāng)料液比固定時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，吸光度值呈現(xiàn)變化緩慢的拋物線趨勢(shì)。兩者相比較，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度值的影響大于料液比。在料液比1∶10時(shí)選擇體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇得到最大響應(yīng)值。

圖7 超聲時(shí)間和料液比對(duì)吸光度的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time and solid-liquid ratio on absorbance

由圖7可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲溫度為70 ℃時(shí)，超聲時(shí)間對(duì)吸光度的影響比料液比更加明顯，在料液比一定的情況下，隨著超聲時(shí)間的增加，黃色素提取液的吸光值也不斷增加，但是當(dāng)增加到一定程度時(shí)速度趨于平緩。

圖8 超聲溫度和料液比對(duì)吸光度的影響Fig.8 Effect of ultrasonic temperature and solid-liquid ratio on absorbance

由圖8可知，選擇70%的乙醇超聲15 min時(shí)，超聲溫度比料液比的變化曲度大，隨著溫度的升高，提取液的吸光度值也不斷增大，但是當(dāng)溫度增加到一定值時(shí)，吸光度的變化就不再明顯，可能是由于溫度過(guò)高造成了色素的損失。

圖9 超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度的影響Fig.9 Effect of ultrasonic time and ethanol volume fraction on absorbance

圖10 超聲溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度的影響Fig.10 Effect of ultrasonic temperature and ethanol volume fraction on absorbance

圖11 超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.11 Effect of ultrasonic temperature and ultrasonic time on absorbance

結(jié)合圖6～圖11和表3中的F值可知，本試驗(yàn)中超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響最大，且各個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響順序由大到小依次為：超聲時(shí)間>超聲溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比。

2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件求解方程，可以得到最優(yōu)的理論值是料液比1∶9.93，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)71.45%、超聲時(shí)間17.52 min和超聲溫度71.26 ℃?？紤]到做試驗(yàn)的實(shí)際情況，也為了方便操作，將理論最佳條件確定為1∶10的橘皮與乙醇之比，71%的乙醇濃度，71 ℃下超聲18 min。

為了檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果是否可靠，按照本試驗(yàn)操作流程在該條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得的吸光度值求平均值為0.759，與響應(yīng)面法預(yù)測(cè)的最優(yōu)結(jié)果0.770基本吻合，因此采用響應(yīng)面法對(duì)橘皮中黃色素的超聲波提取工藝優(yōu)化可行且效果較為良好。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取橘皮中黃色素，通過(guò)常用提取溶劑的對(duì)比篩選確定乙醇為提取劑，在考察固液比(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)、超聲溫度(℃)和超聲時(shí)間(min)單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得出橘皮粉末和70%的乙醇最佳比例是1∶10，最適合的乙醇體積分?jǐn)?shù)為71%，最恰當(dāng)?shù)某晻r(shí)間是18 min，超聲溫度在71 ℃時(shí)提取效果最好，在最優(yōu)條件下提取的橘皮黃色素含量是17.8%，提取效果較好，為橘皮的綜合加工開(kāi)發(fā)提供了理論數(shù)據(jù)，為深入研發(fā)橘皮黃色素生產(chǎn)提供了理論技術(shù)指導(dǎo)。