廖若宇，劉新保，張春娥*，孫悅，譚夢瑤

(1.寧夏回族自治區(qū)糧油產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，銀川 750001；2.寧夏大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，銀川 750001)

黑米，是黑稻加工而成的產(chǎn)品，外觀呈長橢圓形，素有“黑珍珠”和“世界米中之王”的美譽(yù)[1]。與普通白米相比，黑米具有良好的營養(yǎng)價值和功能屬性值，因其內(nèi)部含有大量營養(yǎng)和生物活性成分，如必需氨基酸、功能性脂質(zhì)、膳食纖維、維生素A和E、部分礦物質(zhì)、花青素、酚類化合物、生育酚、植物甾醇和植酸等[2-5]，故而引起越來越多的科研領(lǐng)域工作者的關(guān)注。

花青素，又稱花色素，是一種水溶性天然色素，屬酚類化合物中的類黃酮類物質(zhì)[6]，存在于植物細(xì)胞的液泡中。研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)階段已知的花青素共有23種[7]，其不僅能夠賦予植物鮮艷的色彩，而且能夠預(yù)防動脈粥樣硬化、降血糖、降血脂、抗疲勞、抗氧化及改善貧血等作用[8-10]，在食品、藥品及保健品等多領(lǐng)域均得到廣泛應(yīng)用。作為食品添加劑，可用于飲料、冰糕及果凍等產(chǎn)品的著色，而作為調(diào)味品，可用于調(diào)味料的著色和增香，如咖喱粉、芥末醬及火鍋底料等。因受自身結(jié)構(gòu)及合成途徑的限制，花青素在光照、氧化劑、還原劑、防腐劑或鐵離子存在的環(huán)境中極易分解，致使穩(wěn)定性大大降低。目前，已有學(xué)者對石榴皮[11]、桑葚[12-13]、紫薯[14]及黑豆[15]等植物中花青素的提取純化方式及功能活性成分進(jìn)行研究，并且取得了不錯的研究成果。

本文選用黑米為原材料，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為監(jiān)測指標(biāo)，農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3164-2017《黑米花色苷的測定 高效液相色譜法》[16]為依據(jù)，對標(biāo)準(zhǔn)方法中的提取方法及測定條件進(jìn)行優(yōu)化，改進(jìn)后的方法在保證提取率的同時，能夠有效減少有毒有害試劑的用量及色素的提取成本，為今后黑米中花青素的提取提供了一種綠色高效的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

LC-20AT 液相色譜儀 島津國際貿(mào)易(上海)有限公司；XPE205 分析天平 梅特勒-托利多公司；SAH-B 水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；XC-300C 超聲波清洗機(jī) 濟(jì)寧鑫欣超聲電子設(shè)備有限公司；GL-20G-C高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Lab Dancer 渦旋器 艾卡儀器設(shè)備有限公司；C300A 真空泵 德國Wgiiens公司；HMG-D24 氮吹儀 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；COMFORT純水/超純水機(jī) 德國賽多利斯公司。

1.1.2 材料與試劑

3種黑米產(chǎn)品：市購。

矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(Cy-3-glu)：CAS號：7084-24-4，純度≥95%；95%乙醇(分析純)：安徽安特食品股份有限公司；甲醇(色譜級)：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；鹽酸(優(yōu)級純)：永飛化學(xué)試劑有限公司；甲酸(色譜級)：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；Sep-Pak Vac 3cc NH2 Cartridges固相萃取柱(500 mg)；5 mL一次性注射器：江蘇長城醫(yī)療器械有限公司；0.45 μm水相濾膜；0.45 μm有機(jī)相濾膜。

鹽酸溶液[c(HCl)=1 mol/L]：在200 mL容量瓶中加入適量去離子水，再緩慢加入濃鹽酸16.67 mL，邊加邊振搖，待冷卻至室溫后，定容至200 mL，搖勻。

提取液：95%乙醇和鹽酸溶液(1 mol/L)按照體積85+15混合，即取850 mL 95%乙醇和150 mL的鹽酸溶液混勻后備用。

流動相A：0.5%的甲酸水溶液，取5 mL甲酸，用去離子水定容至1000 mL，使用前過0.45 μm的水相濾膜，并脫氣。

流動相B：0.5%的甲酸甲醇溶液，取5 mL甲酸，用甲醇定容至1000 mL，使用前過0.45 μm的有機(jī)相濾膜，并脫氣。

試驗用水均為去離子水。

1.2 試驗方法設(shè)計

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

精確稱量2.5 mg矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL棕色容量瓶中，提取液定容至刻度，即可得到濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線點的配制

取1 mL矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL棕色容量瓶中，提取液定容至刻度，得到10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間儲備液。再分別從中間儲備液中吸取適量溶液于1 mL的進(jìn)樣瓶中，再次用提取液定容，得到濃度分別為1，2，5，10，20，50，100 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 色譜條件確定

色譜柱：Inertsil ODS-SP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，日本島津公司；檢測波長520 nm，柱溫：30 ℃，流動相：0.5%的甲酸水溶液和0.5%的甲酸甲醇溶液(45∶55，V/V)，流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL，等濃度洗脫，分析時間設(shè)定為10 min，約6 min左右開始出峰。

1.2.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱量0.50 g(精確至0.01 g)粉碎細(xì)度達(dá)80～100目且混合均勻的樣品，置于50 mL離心管中，向其中加入15.00 mL矢車菊色素提取液，混勻后在80 W功率下超聲5 min，隨后在70 ℃恒溫振蕩器上中速振蕩25 min，靜置冷卻至室溫，然后以4000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL比色管中。再向離心管中加入15.00 mL提取液進(jìn)行二次提取，渦旋20 s，重復(fù)上述操作，合并兩次提取液，避光保存待測。

1.2.4 樣品凈化

先用6 mL甲醇活化凈化柱，棄去濾液；再取1 mL待測液上樣，棄去樣液；隨后以5 mL洗脫液(甲醇∶甲酸為1∶1，V/V)洗脫固相萃取柱，收集洗脫液于10 mL小試管中，在45 ℃下氮吹儀上濃縮至干，最后用1 mL提取液復(fù)溶，渦旋混合1 min，待樣品充分溶解后，過0.22 μm尼龍針式過濾器，待上機(jī)分析。

1.2.5 單因素考察及綜合因素優(yōu)化

選取單因素比對法，對試驗過程中的黑米粉粗細(xì)度、提取方式、提取次數(shù)、提取液種類、料液比、水浴振蕩提取溫度、水浴提取時間、凈化柱8個因素分別考察，依據(jù)單因素優(yōu)化出的結(jié)果選取料液比、振蕩提取時間及水浴振蕩提取溫度3個因素，采用Box-Behnken設(shè)計后續(xù)優(yōu)化試驗，響應(yīng)面因素水平見表1。以測得的黑米樣品中的含量為響應(yīng)值。同時通過Design-Expert 8.0.6分析軟件得到二次回歸方程和誤差分析，確定各因素數(shù)值的最優(yōu)組合并對其進(jìn)行驗證。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface experiment

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 黑米粉粗細(xì)度對矢車菊素含量的影響

分別對比20，40，60，80，100目及整米6種不同樣品對矢車菊色素含量的影響(見圖1)，樣品前處理方法參照1.2.3，測定方法見1.2.2。

圖1 黑米粉粗細(xì)度對矢車菊素含量的影響Fig.1 Effect of the particle size of black rice flour on the content of cyanidin

試驗發(fā)現(xiàn)，樣品粉碎后過不同目數(shù)的篩網(wǎng)時，隨著黑米粉顆粒度越來越細(xì)，樣品中的色素含量越來越高，并且混勻后的樣品顏色與樣品顆粒度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，即顆粒度越細(xì)，混勻后的樣品顏色越深。同時在過80目和100目篩網(wǎng)時，有許多肉眼可見的黑色“斑點”存在，從而影響了整個黑米粉的顏色。同樣是粉碎細(xì)度為100目，直接粉碎后的樣品并沒有過篩后的顏色深，由此推斷在篩不同目數(shù)的黑米樣品時，小顆粒度的黑米種皮可能落到靠近底層的篩網(wǎng)中，因此黑米中的色素可能主要存在于種皮中。對黑米種皮、碾后黑米兩種不同樣品中的矢車菊色素含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖2。

圖2 黑米中色素的分布Fig.2 The distribution of pigment in black rice

由圖2可知，黑米中的矢車菊色素確實主要存在于黑米種皮中，而碾后黑米僅含有少量色素。同時通過分析試驗數(shù)據(jù)可得黑米種皮中色素含量是碾后黑米的130倍以上。本著以節(jié)約資源為目的，同時考慮到實際操作的便利性，本設(shè)計選取直接過錘式旋風(fēng)磨后細(xì)度達(dá)100目的樣品進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.2 提取方式對矢車菊素含量的影響

分別對比振蕩30 min、渦旋15 min、超聲30 min及超聲加振蕩共計30 min(超聲5 min，振蕩25 min)4種提取方式對色素含量的影響，見圖3。

圖3 提取方式對矢車菊素含量的影響Fig.3 Effect of extraction methods on the content of cyanidin

樣品前處理方法參照1.2.3，測定方法見1.2.2。試驗發(fā)現(xiàn)，振蕩及超聲兩種提取方式對色素的提取影響基本相近，渦旋提取效果最差，超聲加振蕩兩種方式混合提取后，樣品中矢車菊色素含量較高，因此后續(xù)試驗中均選取超聲和振蕩兩種方式混合提取。

2.1.3 提取次數(shù)對矢車菊素含量的影響

對比不同提取次數(shù)對矢車菊色素含量的影響，見圖4。樣品前處理方法參照1.2.3，測定方法見1.2.2。

圖4 提取次數(shù)對矢車菊素含量的影響Fig.4 Effect of extraction times on the content cyanidin

試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取次數(shù)從1次增加至2次時，色素含量顯著提升，但提取3次時色素含量與提取2次差別不大。由此說明在一定范圍內(nèi)增加提取次數(shù)能夠使樣品中色素被充分提取出來，但并不是提取次數(shù)越多越好。因此，本試驗選取提取2次最佳。

2.1.4 不同提取試劑對矢車菊素含量的影響

通過查閱文獻(xiàn)和資料，得知矢車菊色素易溶于甲醇、乙醇及丙酮，可溶于水。由此推斷該色素易溶于有機(jī)試劑，遂隨機(jī)選取95%乙醇、二氯甲烷、石油醚、丙酮、正己烷、鹽酸與甲醇混合液、鹽酸與95%乙醇混合溶液、鹽酸與水混合溶液共計8種不同提取試劑提取黑米中的矢車菊色素，見圖5。

圖5 不同提取試劑對矢車菊素含量的影響Fig.5 Effect of different extraction reagents on the content of cyanidin

稱取16份0.50 g樣品，置于50 mL離心管中，分別向其中加入15.00 mL不同提取液，每種提取液設(shè)置兩個平行，混勻后在80 W功率下超聲5 min，隨后在65 ℃恒溫振蕩器上中速振蕩25 min，靜置冷卻至室溫，然后以4000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL比色管中。重復(fù)上述操作2次，待上機(jī)測試分析。測定結(jié)果表明，依據(jù)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3164-2017《黑米花色苷的測定 高效液相色譜法》中鹽酸與甲醇混合液以及鹽酸與95%乙醇混合溶液提取效果較好，但考慮提取效果最佳、試劑毒性較小，首選鹽酸與95%乙醇混合溶液作為后續(xù)試驗的提取溶液。

2.1.5 不同料液比對矢車菊素含量的影響

選取鹽酸與95%乙醇混合溶液為提取液，以農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的鹽酸與甲醇混合液作參考，分別對比不同料液比下黑米中矢車菊色素含量，見圖6。

圖6 不同料液比對矢車菊素含量的影響Fig.6 Effect of different solid-liquid ratios on the content of cyanidin

稱取20份0.50 g樣品，置于50 mL離心管中，分別向其中加入10，20，30，40，50 mL的提取液，每個水平設(shè)置兩個平行，混勻后在80 W功率下超聲5 min，隨后在65 ℃恒溫振蕩器上中速振蕩25 min，靜置冷卻至室溫，然后以4000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至體積適量的比色管中。重復(fù)上述操作2次，待上機(jī)測試分析。結(jié)果顯示，料液比為0.5∶40時，兩種提取液提取色素的效果均優(yōu)于其他，同時鹽酸與95%乙醇混合溶液作為提取液時，效果明顯優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)中提取液的提取效果。因此,本試驗選取鹽酸與95%乙醇混合溶液作為提取試劑，提取試劑添加量為40 mL。

2.1.6 不同振蕩溫度對矢車菊素含量的影響

考察不同溫度對矢車菊色素含量的影響，見圖7。

圖7 不同振蕩溫度對矢車菊素含量的影響Fig.7 Effect of different oscillation temperatures on the content of cyanidin

稱取10份0.50 g樣品，置于50 mL離心管中，加入20.00 mL提取液，混勻后在80 W功率下超聲5 min，隨后分別在35，45，55，65，75 ℃恒溫振蕩器上中速振蕩25 min，每個水平兩個平行，靜置冷卻至室溫，然后以4000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL比色管中。重復(fù)上述操作2次，待上機(jī)測試分析。結(jié)果顯示：在溫度為65 ℃下，恒溫振蕩提取黑米中的矢車菊色素效果較好。因此，本試驗選擇提取溫度為65 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.7 不同提取(超聲提取+恒溫振蕩提取)總時間對矢車菊素含量的影響

考察不同提取總時間對黑米中矢車菊色素含量的影響，見圖8。

圖8 不同提取總時間對矢車菊素含量的影響Fig.8 Effect of different extraction total time on the content of cyanidin

稱取10份0.50 g樣品，置于50 mL離心管中，加入20.00 mL提取液，混勻后在80 W功率下超聲5 min，隨后分別在65 ℃恒溫振蕩器上中速振蕩5，10，15，20，25 min，靜置冷卻至室溫，然后以4000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL比色管中。重復(fù)上述操作2次，待上機(jī)測試分析。結(jié)果顯示：當(dāng)超聲提取時間固定為5 min，振蕩提取時間為5～15 min內(nèi)，黑米中提取的矢車菊色素含量差別不大，當(dāng)提取時間增加至20 min時，提取效果略優(yōu)于其他幾個條件。因此，本試驗選取總提取時間為25 min，即超聲5 min，振蕩20 min。

2.1.8 不同凈化柱的選擇對矢車菊素含量的影響

由于黑米樣品中存在矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷2種花色苷，本試驗測定矢車菊色素時樣品基線不穩(wěn)，猜測可能是芍藥色素對其產(chǎn)生了干擾，為避免長時間測定對后續(xù)樣品產(chǎn)生干擾及污染色譜柱，嘗試選擇利用固相萃取柱凈化樣品。稱取12份0.50 g樣品，置于50 mL離心管中，向其中加入20.00 mL矢車菊色素提取液，混勻后在80 W功率下超聲5 min，隨后在65 ℃恒溫振蕩器上中速振蕩20 min，靜置冷卻至室溫，然后以4000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL比色管中。重復(fù)上述操作2次，按照1.2.4的方法凈化樣品，分別選取PWAX、Strata、C18、FL、NH2、3cc 6種凈化柱凈化同一樣品，每種凈化柱設(shè)置兩個平行，試驗結(jié)果見圖9。

圖9 不同凈化柱的選擇對矢車菊素含量的影響Fig.9 Effect of different purification columns on the content of cyanidin

結(jié)果表明，NH2和3cc兩種小柱的凈化效果明顯好于其他種類的凈化柱，并且所選擇的6種凈化柱中，3cc最優(yōu)。因此，后續(xù)試驗中選擇最佳凈化柱3cc。

選取3cc凈化柱，活化小柱后，分別添加2%甲酸水及25%氨水甲醇，制造酸性及堿性環(huán)境條件，并在此條件下對樣品進(jìn)行凈化以測定色素含量，試驗結(jié)果見圖10。

圖10 不同酸堿條件下凈化柱對黑米中矢車菊素凈化效果比對Fig.10 Comparison of purification columns on purification effects of cyanidin in black rice under different acid and alkali conditions

試驗發(fā)現(xiàn)，在酸性環(huán)境中，樣品隨著上樣后樣液流出而流失，無法留存于凈化柱上，造成樣品中色素含量降低。堿性環(huán)境與酸性環(huán)境類似，但流失量較酸性環(huán)境少一些，推測可能是由于色素提取過程中的部分酸與活化凈化柱后添加的堿液反應(yīng)，從而造成色素流失。因此，本試驗選取中性條件，即活化固相萃取小柱后直接上樣的方式凈化樣品。

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 建立二次回歸方程及誤差分析

對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合得到二次回歸方程為：矢車菊素含量=3.60238+0.033800A-0.11970B+9.50000E-3C+4.45000E-4AB-6.85000E-4AC+1.59000E-3BC。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 The design and results of response surface test

通過ANOVA進(jìn)行回歸方程誤差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis results of response surface test

由表3可知，該模型回歸顯著，失擬項不顯著，模型CV=0.87%，R2=0.8327，RAdj2=0.7323，其中CV值與模型置信度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而相關(guān)系數(shù)R2和RAdj2越接近1，模型相關(guān)性則越好。本試驗中數(shù)據(jù)表明該模型與實際試驗擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于黑米中矢車菊色素的提取與含量預(yù)測。另外，所考察的3個因素中，C對黑米中矢車菊色素提取的影響高度顯著；B、BC的影響顯著；A、AB、AC的影響不顯著，各因素影響從大到小依次為振蕩提取時間>料液比>加熱溫度。

2.2.2 優(yōu)化組合驗證試驗

為確定最佳提取方式，使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化，得到提取黑米中矢車菊色素的最佳方案為：料液比0.5∶30，振蕩提取時間25.00 min，振蕩提取加熱溫度70.00 ℃，預(yù)估黑米中矢車菊色素含量為3.967 mg/g。對上述條件進(jìn)行試驗結(jié)果的驗證，結(jié)果見表4。

表4 最優(yōu)組驗證試驗Table 4 The validation test of optimal group

由表4可知，最優(yōu)組矢車菊色素提取含量為3.972 mg/g，達(dá)到了理論預(yù)測值，同時兩者相對誤差約為0.005 mg/g，表明響應(yīng)面軟件優(yōu)化后得出的回歸方程有一定的實踐指導(dǎo)意義。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

圖11 矢車菊色素標(biāo)準(zhǔn)品譜圖Fig.11 The spectrum of cyanidin pigment standard sample

圖12 矢車菊色素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.12 The standard curve of cyanidin pigment

以1.2.1.2的方法配置各個標(biāo)準(zhǔn)曲線點，以1.2.2 色譜條件上機(jī)測定。矢車菊色素標(biāo)品譜圖見圖11。以濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程，見圖12。當(dāng)矢車菊色素在1～100 μg/mL范圍內(nèi)時，濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為f(x)=24040.5x-10797.8，R=0.9999。最低檢出限為0.5 μg/mL，定量限為2 μg/mL。

2.4 樣品含量測定

隨機(jī)購買市面上3種不同品牌的黑米樣品，對其矢車菊色素含量進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表5。

表5 樣品中矢車菊色素含量Table 5 The content of cyanidin pigment in samples

由表5可知，3種不同黑米樣品，未凈化時內(nèi)部矢車菊色素含量在2.953～3.487 mg/g之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.470%～3.590%，而經(jīng)過凈化的樣品，其矢車菊色素含量在2.596～3.452 mg/g之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.134%～4.229%，證明經(jīng)過凈化后的樣品，矢車菊素含量損失在0.5 mg/g范圍內(nèi)，可根據(jù)實際需求，選擇是否需要凈化樣品。

3 結(jié)論

本文在傳統(tǒng)液相色譜法測定的基礎(chǔ)上，結(jié)合使用固相萃取小柱凈化樣品。經(jīng)驗證，相比于農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3164-2017《黑米花色苷的測定 高效液相色譜法》，本方法更加綠色環(huán)保，在保證提取率的同時，有效減少了有機(jī)試劑的污染及提取成本，為黑米中矢車菊色素的提取提供了一種可靠方法。本試驗研究得出當(dāng)料液比為0.5∶15，超聲提取時間為5.00 min，振蕩提取時間為25.00 min，振蕩提取加熱溫度為70.00 ℃，重復(fù)2次提取時，能夠有效提取黑米中的矢車菊色素，測得其含量為3.972 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.54%。同時，利用Sep-Pak Vac 3cc NH2 Cartridges固相萃取柱凈化后的樣品雜質(zhì)干擾小、分離度好，能夠更加準(zhǔn)確地定量出黑米樣品中的矢車菊色素含量。綜上所述，本文為黑米中天然色素的提取、凈化及測定提供了一種新的、快速、可靠的方法。