薛小蘭 范瑜珊

摘?要：為明確灰樹花粗多糖的抑菌和抗氧活性，以灰樹花為原料，采用熱水浸提、醇沉得到灰樹花多糖，同時(shí)采用牛津杯法研究灰樹花粗多糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，通過(guò)DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、總還原力測(cè)定研究灰樹花粗多糖的抗氧化活性。結(jié)果表明：灰樹花粗多糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，抑菌圈直徑分別為12 mm和14 mm;灰樹花粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用較強(qiáng)，在濃度為0.2～1.6 mg·mL-1??范圍內(nèi)，清除率隨著濃度的增加而明顯上升，濃度為1.6 mg·mL-1??時(shí)清除率達(dá)到78.13%，當(dāng)濃度增加到2.0 mg·mL-1??時(shí)清除率降低（72.32%）。灰樹花粗多糖對(duì)羥基自由基的清除能力較弱，濃度0.2 mg·mL-1??時(shí)的清除率為5.96%，濃度為2.0 mg·mL-1??時(shí)清除率為23.57%。灰樹花粗多糖的總還原力也比較弱，在濃度0.2～2.0 mg·mL-1??，總還原力（OD）值為0.2～0.4。

關(guān)鍵詞：灰樹花;粗多糖;抑菌;抗氧化

中圖分類號(hào)：S 646?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：0253-2301（2021）09-0015-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.09.003

Preliminary Study on Antibacterial and Antioxidant Activities ofCrude Polysaccharide Extract from Grifola Frondosa

XUE Xiao?lan， FAN Yu?shan

（Fujian Vocational College of Bioengineering， Fuzhou， Fujian 350007， China）

Abstract： In order to determine the antibacterial and antioxidant activities of crude polysaccharides in Grifola frondosa， by using Grifola frondosa as the raw material， the polysaccharides were prepared from Grifola frondosa by hot water extraction and alcohol precipitation. Meanwhile， the oxford cup method was used to study the antibacterial effect of crude polysaccharides in Grifola frondosa on Escherichia coli and Staphylococcus aureus， and the antioxidant activity of crude polysaccharides in Grifola frondosa was determined by DPPH free radical scavenging capacity， hydroxyl radical scavenging ability and total reducing power. The results showed that crude polysaccharides in Grifola frondosa had antibacterial effects on Escherichia coli and Staphylococcus aureus， and the diameters of inhibition zone were respectively 12 mm and 14 mm. The crude polysaccharides in Grifola frondosa had strong scavenging effect on DPPH free radical， and the scavenging rate increased with the increase of concentration in the range of 0.2-1.6??mg·mL-1??. The scavenging rate reached 78.13?% when the concentration was 1.6??mg·mL-1??， while decreased??to 72.32?% when the concentration was 2.0??mg·mL-1??. The total reducing power （OD） of crude polysaccharides in Grifola frondosa was also weak. The total reducing power （OD） value was 0.2-0.4??at the concentration of 0.2-2.0??mg·mL-1??.

Key words： Grifola frondosa; Crude polysaccharide; Bacteriostatic; Antioxidant

灰樹花俗稱舞菇，是最近幾年開發(fā)起來(lái)的一種食藥兩用菌，屬于真菌類。灰樹花營(yíng)養(yǎng)豐富，居各種食用菌之首。子實(shí)體中含有大量的氨基酸、蛋白質(zhì)及多種有益的礦物質(zhì)，所以當(dāng)灰樹花與其他食物一起食用時(shí)，可以平衡營(yíng)養(yǎng)成分及提高機(jī)體對(duì)蛋白的吸收，促進(jìn)人體健康。此外灰樹花也是一種非常寶貴的中藥，中醫(yī)認(rèn)為灰樹花性甘、平、無(wú)毒，具有清熱解暑、益氣健脾、利水消腫的功效，是上品中藥，對(duì)健康者具有保健作用，對(duì)病人有輔助治療作用。隨著灰樹花人工栽培技術(shù)的成熟和產(chǎn)量的大幅度提高，灰樹花已形成良好的產(chǎn)業(yè)鏈，其作為藥食兼用的食用菌已經(jīng)備受世人的矚目。

近幾年，大量研究發(fā)現(xiàn)灰樹花含有多種生物活性物質(zhì)，其中最主要的一類活性成分是灰樹花多糖，它具有顯著的抗腫瘤、抗HIV、抗病毒、調(diào)節(jié)血糖、降血壓及能抗氧化等作用。張媛媛等[1] 從灰樹花子實(shí)體多糖分離得到分子量為29.574 kDa的多糖組分GFD1?，該多糖組分對(duì)于人體肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制效果顯著。Kubo等[2] 從灰樹花子實(shí)體中提取出粗多糖，分離、純化后，顯示含有a（14）

8（16）葡聚糖，可以明顯地降低血糖值。葛健康等[3] 采用水提醇沉的方法得到灰樹花提取物粗品對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠和鏈脲佐茵素導(dǎo)致的糖尿病小鼠有醫(yī)治和調(diào)節(jié)免疫功效。張立霞等[4] 用大鼠設(shè)計(jì)試驗(yàn)，表明灰樹花多糖有降低血壓的功效且可以保護(hù)心臟、腎臟的破損。付佳樂(lè)等[5] 用灰樹花提取物進(jìn)行體外抑菌和抗氧化活性研究。前人關(guān)于灰樹花多糖的研究主要集中于基于動(dòng)物試驗(yàn)法的抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、降血壓等藥理作用和藥理機(jī)制方面，而對(duì)多糖的抑菌和抗氧化活性研究甚少。本研究采用熱水浸提，然后醇沉得到灰樹花粗多糖，同時(shí)對(duì)提取的灰樹花粗多糖進(jìn)行體外抑菌和抗氧化活性研究，旨在為進(jìn)一步分離純化得到小分子物質(zhì)并研究其抑菌和抗氧化機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，也為灰樹花多糖類制劑或保健品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?供試材料及試驗(yàn)藥劑

供試材料為灰樹花（購(gòu)自浙江省慶元縣）。試驗(yàn)藥劑主要有：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)水乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、1，1二?苯基苦基苯肼（DPPH）、硫酸亞鐵、30%過(guò)氧化氫、水楊酸、抗壞血酸、磷酸緩沖液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵（均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2?試驗(yàn)主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、數(shù)顯三用水浴鍋 HH3A （金壇市精達(dá)儀器制造有限公司）;電子分析天平 FA2004N（上海精天電子儀器廠）;循環(huán)水式多用真空泵 SHZDIII（鞏義市予華儀器有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R系列（上海申生科技有限公司）;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DHG9240A（上海一恒科技有限公司）;低速離心機(jī) SC3612（科大創(chuàng)新股份有限公司）;紫外可見分光光度計(jì)TU1810（普析通用有限公司）。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?熱水浸提法提取灰樹花粗多糖?灰樹花經(jīng)除雜、干燥、粉碎等預(yù)處理后，得到灰樹花干粉。準(zhǔn)確稱取10 g灰樹花干粉放入裝有200 mL蒸餾水燒杯中，調(diào)節(jié)pH值7.5、90℃水浴加熱2 h。然后抽濾得到濾液，將濾液倒入圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，得到膏狀的提取物，加入無(wú)水乙醇（與提取物的體積比3∶1），冷藏過(guò)夜，收集沉淀物，去除乙醇得到灰樹花粗多糖。把得到的粗多糖置于真空干燥箱中干燥（80℃、6 h），然后計(jì)算其產(chǎn)率。

1.3.2?灰樹花粗多糖含量的測(cè)定?試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[6] ：稱取葡萄糖10 mg加蒸餾水溶解于燒杯，于100 mL容量瓶定容，分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，依次加入蒸餾水至2 mL。分別加入1 mL的5%苯酚溶液混勻，然后立即加入5 mL濃硫酸，充分混勻，90℃水浴中顯色15 min，冷卻，在波長(zhǎng)490 nm下測(cè)吸光度A，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-0.0126+0.0139x，R?2=0.9958。配制濃度為0.1 mg·mL-1??灰樹花粗多糖溶液，按照上述操作測(cè)得吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算多糖純度。

1.3.3?灰樹花粗多糖抑菌活性試驗(yàn)

（1）菌懸液的制備：在超凈工作臺(tái)下用無(wú)菌接種環(huán)將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌用適量的無(wú)菌生理鹽水清洗下來(lái)，稀釋并充分搖勻，使各個(gè)菌種懸液中的菌細(xì)胞濃度為10-6?～?10-5??CFU·mL-1?。

（2）抑菌試驗(yàn)：采用牛津杯法[7] 對(duì)抑菌效果進(jìn)行測(cè)定。吸取1 mL的菌液到含有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的平板上，用涂布棒將菌液涂布均勻，在培養(yǎng)基表面等距放置3個(gè)牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)縫隙。然后在杯子加已配置好的濃度為1 g·mL-1??的灰樹花粗多糖溶液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，設(shè)置溫度37℃，16～18 h后取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算平均值。用無(wú)菌水作空白對(duì)照。

1.3.4?灰樹花粗多糖抗氧化試驗(yàn)

1.3.4.1?DPPH清除能力測(cè)定?試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。配制濃度梯度0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·mL-1??的粗多糖溶液，分別取2 mL，依次加入0.04 mg·mL-1??的DPPH乙醇溶液2 mL輕輕震蕩，混合均勻，并置于暗室內(nèi)反應(yīng)30 min，于4500??r·min-1??離心15 min，在517 nm處測(cè)量樣品的吸光值A(chǔ)樣品?。其中對(duì)照組樣液用等體積的去離子水代替，測(cè)定吸光值A(chǔ)對(duì)照?，空白組中用無(wú)水乙醇代替樣品組中的DPPH乙醇溶液，測(cè)定吸光值A(chǔ)空白?，使用Vc為陽(yáng)性對(duì)照。 DPPH清除率的計(jì)算公式為： DPPH清除率（%）=[1-（A樣品?-A空白?）/A對(duì)照?]×100%

1.3.4.2?羥自由基清除能力測(cè)定?試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。稱取適量的灰樹花粗多糖提取物，分別用水稀釋成0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·mL-1??的濃度梯度溶液2 mL。依次加入9 mmol·L-1??硫酸亞鐵溶液2 mL，9 mmol·L?乙醇水楊酸2 mL，8.8 mmol·L-1??雙氧水2 mL，37℃水浴15 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)樣品?。其中對(duì)照組樣液用等體積的去離子水代替，測(cè)定吸光值A(chǔ)（對(duì)照）?，空白組中用蒸餾水代替雙氧水溶液，測(cè)定吸光值A(chǔ)（空白）?。 Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。OH清除率的計(jì)算公式：

OH清除率（%）= [1-（A樣品?-A空白?）/A對(duì)照?]×100%。

1.3.4.3?總還原力的測(cè)定?試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。稱取適量的灰樹花粗多糖提取物，分別用水稀釋成0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·mL-1??的濃度梯度溶液，依次加入0.2 moL·L-1??、pH為6.6的磷酸緩沖液2 mL、1%鐵氰化鉀溶液2 mL，混勻后在50℃水浴中反應(yīng)20 min。取出后迅速加入2 mL10%三氯乙酸，并放于于離心機(jī)中3000??r·min-1??離心10 min。取上清液2 mL加入2 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，在700 nm處測(cè)其吸光值。Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。還原力的計(jì)算公式：還原力=A樣品?-?A空白?。

2?結(jié)果與分析

2.1?灰樹花粗多糖抑菌活性測(cè)定

如圖1所示，灰樹花粗多糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果更明顯。經(jīng)測(cè)量，大腸桿菌的抑菌直徑為12 mm，金黃色葡萄球菌的抑菌直徑為14 mm。

2.2?灰樹花粗多糖DPPH自由基清除能力測(cè)定

如圖2所示，灰樹花粗多糖對(duì)DPPH自由基具較強(qiáng)的清除作用。在0.2～1.6 mg·mL-1??的濃度范圍內(nèi)，灰樹花粗多糖對(duì)DPPH自由基清除率隨濃度的增大而升高，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，灰樹花多糖含量在1.6 mg·mL-1??時(shí)，清除率達(dá)到78.13%，當(dāng)超過(guò)1.6 mg·mL-1??濃度范圍后，清除率略有下降。Vc對(duì)DPPH自由基清除率基本在90%左右，說(shuō)明Vc對(duì)DPPH自由基清除率強(qiáng)于灰樹花粗多糖，但隨著濃度的增大，兩者對(duì)DPPH自由基的清除率接近。

2.3?灰樹花粗多糖羥基自由基清除能力測(cè)定

如圖3所示，灰樹花粗多糖對(duì)羥基自由基的清除作用較弱。在濃度0.2～2.0 mg·mL-1??范圍內(nèi)，灰樹花粗多糖對(duì)羥基自由基的清除作用隨著濃度的增大而升高，灰樹花粗多糖濃度為0.2

mg·mL-1??時(shí)，羥基自由基的清除率僅為5.96%，濃度為2.0 mg·mL-1??時(shí)羥基自由基的清除率達(dá)到23.57%。Vc對(duì)羥基自由基的清除率隨著濃度急劇增大，在濃度2.0 mg·mL-1??時(shí)清除率達(dá)到96%。由此可見在高濃度時(shí)，Vc對(duì)羥基自由基的清除效果強(qiáng)于灰樹花粗多糖。

2.4?灰樹花粗多糖總還原力的測(cè)定

如圖4所示，在濃度0.2～2.0 mg·mL-1??范圍內(nèi)，灰樹花粗多糖的總還原力值在0.2～0.4，而在同濃度范圍內(nèi)，Vc的OD值為1.7～6.9，可見灰樹花粗多糖的OD值遠(yuǎn)低于Vc，但還是具有一定的還原力，且和濃度呈量效關(guān)系。

3?討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明灰樹花粗多糖提取物具有體外抑菌和抗氧化活性。抑菌研究過(guò)程中，灰樹花粗多糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果。抗氧化活性研究中，粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用較強(qiáng)，在濃度低至0.2 mg·mL-1??時(shí)DPPH自由基的清除率達(dá)到33.93%，隨著濃度的增加，清除率明顯上升，當(dāng)濃度為1.6 mg·mL-1??時(shí)灰樹花粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到78.13%，然后隨著濃度的增大清除率略有降低，濃度增大到2.0 mg·mL-1??清除率降低到72.32%?；覙浠ù侄嗵菍?duì)羥基自由基的清除作用隨著濃度的增加變化也比較明顯，濃度為0.2 mg·mL-1??時(shí)羥基自由基清除率5.96%，濃度為2.0 mg·mL-1??時(shí)羥基自由基清除率達(dá)到23.57%，但是均低于同濃度的Vc，清除率是Vc的25%?；覙浠ù侄嗵堑腛D值比Vc小，在濃度0.2～2.0 mg·mL-1??范圍內(nèi)，灰樹花粗多糖的OD值為0.2～0.4，可能是灰樹花粗多糖中含有的還原性物質(zhì)比較少，導(dǎo)致還原能力不強(qiáng)。

本研究未對(duì)灰樹花粗多糖的抑菌活性進(jìn)行定量試驗(yàn)，其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度還有待研究。此外，本研究中從灰樹花提取的粗多糖成分比較復(fù)雜，其粗多糖不僅含有多糖，還含有多酚、蛋白、礦物離子等物質(zhì)，其中多酚具有抑菌和抗氧化功效[11-13] 。因此，灰樹花粗多糖的抑菌和抗氧化活性成分和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，今后的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)是對(duì)粗多糖進(jìn)一步分離純化得到小分子物質(zhì)，并對(duì)小分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和抑菌及抗氧化活性機(jī)制進(jìn)行研究，為營(yíng)養(yǎng)保健品的開發(fā)和醫(yī)藥方面研制開發(fā)提供詳細(xì)的資料。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）