陳 云，龔偉偉，鐘素芬，孟國梁*

（南通大學藥學院，南通 226001）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DW）是一種常見的代謝性疾病,目前全世界成人DW 患者約4.63 億,預計到2045 年將增至6.93 億[1]。DW 患者長期高血糖會引發(fā)多種并發(fā)癥,其中糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCW）是一種常見的心血管并發(fā)癥,可出現(xiàn)獨立于冠狀動脈粥樣硬化、高血壓和其他心血管危險因素以外的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常,主要表現(xiàn)為心肌僵硬、心肌纖維化、肥厚,造成心臟舒張功能障礙和收縮功能受損[2],但尚缺乏行之有效的治療方法。

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHY）是藤茶中含量最豐富的天然黃酮類化合物,具有多種藥理學作用[3]。DHY 能提高果蠅應激耐受性,減緩腸道功能障礙,延長果蠅壽命[4]；促進自噬,減輕DW 腎間質(zhì)纖維化[5]；抑制動脈粥樣硬化斑塊形成,促進脂質(zhì)代謝,延緩載脂蛋白E 敲除小鼠的動脈粥樣硬化進展[6],然而,DHY 能否保護DCW 尚不明確。本研究旨在探討DHY 對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的小鼠DCW 的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 8 周齡雄性C57BL/6 小鼠購自南通大學實驗動物中心（動物倫理編號:S20200323-095）。STZ購自美國Sigma-Aldrich 公司,DHY（純度＞98%）購自西安天豐生物科技有限公司,羧甲基纖維素鈉（carboxymethycellulose，CWC）購自中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司,去乙?；?（sirtuin 3，SIRT3）抗體和受體相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DW 小鼠模型構(gòu)建 小鼠禁食12 h,腹腔注射STZ 60 mg/（kg·d-1）,連續(xù)5 d,對照組（control 組）小鼠腹腔注射等量的枸櫞酸鹽緩沖液。尾靜脈取血,利用One-Touch 血糖儀測定小鼠空腹血糖,＞16.7 mmol/L為DW 組。2 周后,小鼠予溶于0.5% CWC 的DHY 250 mg/（kg·d-1）灌胃,對照組予等量的0.5%CWC,持續(xù)12 周。實驗期間每2 周定期測定小鼠空腹血糖。

1.2.2 糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）測定 小鼠眼球取血,1 000 r/min 離心10 min,沉淀即為紅細胞。然后用生理鹽水洗滌紅細胞以制備溶血液,酸化后100 ℃加熱水解1 h,加入蛋白沉淀劑渦旋混勻后,3 500 r/min 離心10 min,取上清,加入顯色劑,40 ℃水浴保溫30 min,冷卻后于443 nm 處測吸光度值,計算HbA1c 含量。

1.2.3 超聲心動圖測定 小鼠用異氟烷（1%～2%）麻醉后,使用Visual Sonic Vevo 2100 型小動物超聲成像系統(tǒng)經(jīng)胸骨長軸視圖檢測心臟構(gòu)型,使用W 型超聲心動圖記錄圖像,測量射血分數(shù)（ejection fraction，EF）和短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S）。取心尖四腔切面,多普勒取樣容積置于二尖瓣下,聲束與室間隔平行,獲得心室舒張期E 峰和A 峰血流,計算舒張期E 峰與A 峰比值（E/A 值）。

1.2.4 丙二醛（malondialdehyde，WDA）測定 取30 mg心肌組織加入300 μL 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）進行勻漿；4 ℃,12 000 r/min 離心10 min,棄沉淀,吸取上清備用。按說明書要求制備檢測體系,利用酶標儀在532 nm 測定各樣品吸光度值,根據(jù)標準曲線計算心肌組織WDA 水平。

1.2.5 總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測 取20 mg 心肌組織加入100 μL 預冷的PBS勻漿,4 ℃,12 000 r/min 離心5 min,吸取上清液備用。按說明書要求制備檢測體系,利用酶標儀在593 nm處檢測各孔吸光度值,根據(jù)標準曲線計算心肌組織T-AOC。

1.2.6 蛋白印跡（Western Blot）取左心室組織塊30 mg,洗凈吸干,加入300 μL 蛋白裂解液。剪碎組織塊勻漿后,置于冰上裂解40 min。4 °C 12 000 r/min 離心15 min,取上清,BCA 法測定蛋白濃度,加入上樣緩沖液煮沸5 min,保存?zhèn)溆谩５鞍讟悠方?jīng)十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶封閉后,分別用SIRT3（1∶1 000）和RIPK3（1∶1 000）一抗4 °C 孵育過夜,換用二抗室溫下孵育2 h。滴加增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影液顯像,Image J 分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示,使用Stata 13.0 軟件,采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）及Bonferroni post hoc 檢驗進行比較,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 DHY 對DW 小鼠空腹血糖和HbA1c 水平的作用 與control 組相比,小鼠腹腔注射STZ 后空腹血糖濃度均＞16.7 mmol/L,HbA1c 水平升高,提示成功構(gòu)建DW 模型；DHY 治療12 周后顯著降低DW 小鼠空腹血糖和HbA1c 水平（圖1）。

圖1 DHY 對糖尿病小鼠血糖和HbA1c 的影響

2.2 DHY 對DW 小鼠心功能的影響 與control 組相比,DW 小鼠EF、FS 和E/A 均顯著降低,提示DW小鼠心臟收縮和舒張功能障礙,出現(xiàn)典型的DCW 癥狀；DHY 治療后顯著增加EF、FS 和E/A,改善DW小鼠心臟收縮和舒張功能（圖2）。

圖2 DHY 對DW 小鼠心功能的影響

2.3 DHY 對DW 小鼠心肌氧化應激的影響 與control 組相比,DW 小鼠心肌WDA 水平顯著升高,T-AOC 顯著降低,提示DW 小鼠心肌組織氧化應激損傷加重；DHY 治療后,小鼠心肌WDA 水平降低,T-AOC 升高,表明DHY 能減輕DW 小鼠心肌的氧化應激損傷（圖3）。

圖3 DHY 對DW 小鼠心肌氧化應激的影響

2.4 DHY 對DW 小鼠心肌SIRT3 和RIPK3 蛋白表達的作用 與control 組相比,DW 小鼠心肌SIRT3表達降低,RIPK3 表達升高；DHY 治療后明顯增加SIRT3 表達,抑制DW 小鼠心肌RIPK3 的表達（圖4）。

圖4 DHY 對DW 小鼠心肌SIRT3 和RIPK3 蛋白表達的影響

3 討 論

STZ 是一個對胰島β 細胞具有高度選擇性的毒性物質(zhì),能干擾葡萄糖的轉(zhuǎn)運,影響葡萄糖激酶的功能,促進胰島細胞DNA 甲基化和DNA 鏈斷裂,破壞胰島β 細胞并導致胰島素分泌不足,誘導產(chǎn)生DW[7]。DHY 是從顯齒蛇葡萄莖和葉中分離出的一種黃酮類化合物,具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護心臟、清除自由基等作用[3]。值得注意的是,DHY 可激活小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞中的過氧化物酶體增殖物激活受體γ,改善胰島素抵抗[8]；DHY 也可上調(diào)心肌組織中胰島素受體底物-1 的磷酸化水平,改善（Lepr）KO/KO（db/db）小鼠的代謝紊亂和胰島素抵抗[9],這可能也是本研究中DHY 抑制STZ 誘導DW 小鼠血糖濃度和HbA1c 水平,進而改善心功能的主要原因。

DHY 通過抗氧化作用發(fā)揮藥理作用,比如DHY抑制氧化應激減輕HT22 細胞氧糖剝奪/復氧損傷[10],通過下調(diào)miR-34a 減輕高糖誘導的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞氧化應激[11],減輕DW 小鼠胸主動脈氧化應激水平[12]。由于DW 患者持續(xù)的高血糖引起活性氧過量產(chǎn)生,從而在DCW 中發(fā)揮重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)DHY 降低DCW 小鼠心肌WDA 水平,T-AOC 升高,提示DHY 減弱DCW 小鼠心肌氧化應激水平,這可能是DHY 抗DCW 的重要機制之一。

DHY 抗氧化應激的確切機制尚不清楚。本課題組既往研究[12]發(fā)現(xiàn),DHY 依賴增加血管組織中SIRT3表達進而減輕氧化應激,并改善DW 小鼠胸主動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能。SIRT3 是一種位于線粒體內(nèi)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白去乙?；?調(diào)節(jié)線粒體呼吸、三磷酸腺苷合成、氧自由基生成及清除等過程。SIRT3 可通過調(diào)節(jié)叉頭蛋白3a（forkhead-box-protein 3a，F(xiàn)OXO3a）和超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）等靶蛋白去乙?；揎?降低WDA,增強T-AOC,抑制體內(nèi)的氧化應激水平[7，14]。相反,SIRT3 缺失可促進氧化應激,加重DW心肌損傷[7]。因此,DHY 增加DCW 小鼠心肌中SIRT3表達,可能是DHY 減輕氧化應激、改善DCW 的重要機制之一。

壞死性凋亡作為一種新近發(fā)現(xiàn)的可調(diào)控的細胞壞死,在心肌缺血再灌注、肺炎鏈球菌感染引起的心臟損傷、動脈粥樣硬化等心血管疾病中發(fā)揮重要作用[15]。RIPK3 作為壞死性凋亡信號通路中的核心分子,表達增加是壞死性凋亡的重要標志之一[16]。RIPK3 升高后,磷酸化RIPK1,進而通過RIPK 同型相互作用基序相結(jié)合形成一種信號復合物,即壞死性小體,激活混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain like protein，WLKL）多個位點磷酸化,促進形成二硫鍵依賴的WLKL 聚合物,形成RIPK1-RIPK3-WLKL 復合物,然后轉(zhuǎn)移至細胞膜并促使細胞破裂,驅(qū)動壞死性凋亡的執(zhí)行[17]。有證據(jù)[18]表明,心肌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)損傷后過量產(chǎn)生的氧自由基可誘導心肌細胞壞死性凋亡；另一方面,壞死性凋亡又會促進氧自由基產(chǎn)生、加重細胞損傷[18]。本課題組既往研究[16]發(fā)現(xiàn),高糖刺激上調(diào)心肌細胞RIPK3 表達,促進壞死性凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),DHY 降低DCW 小鼠心肌中RIPK3 表達,提示DHY抑制DW 心肌壞死性凋亡,這可能與DHY 減輕氧化應激密不可分,同時也會進一步減弱氧化損傷,形成良性循環(huán),從而改善心功能。

綜上所述,DHY 增加DW 小鼠心肌組織中SIRT3 表達,抑制氧化應激,減弱壞死性凋亡,增強心臟收縮和舒張功能,改善DCW,為DCW 防治提供了新思路,具有潛在的轉(zhuǎn)化應用前景。