程 曉，王 澍，谷 苗，王 鈺，何江虹*

（南通大學神經(jīng)再生重點實驗室，神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001）

近年來,隨著組織工程生物材料的研究不斷深入,組織工程材料表面結(jié)構(gòu)形貌可以引導軸突和神經(jīng)細胞取向性生長,誘導干細胞向神經(jīng)細胞定向分化,在神經(jīng)再生中具有重要影響。在干細胞的增殖和分化中,局部微環(huán)境起到關(guān)鍵性作用[1]。因此建立體外干細胞在生物材料上的培養(yǎng)生長條件體系,對于研究干細胞在生物材料上的增殖、生長、分化等十分重要。

皮膚源性前體細胞（skin-derived precursors，SKPs）是來源于胚胎期神經(jīng)嵴干細胞,具有高分裂增殖性、多分化潛能的皮膚源性神經(jīng)干細胞,易獲取,是一種理想的組織工程種子細胞,在神經(jīng)損傷修復微環(huán)境中可發(fā)揮多重效用[2-3]。本研究通過比較不同血清濃度培養(yǎng)條件下,SKPs 在蝶翅和殼聚糖膜等具有表面結(jié)構(gòu)形貌的生物材料上的增殖生長情況,獲取SKPs在材料上培養(yǎng)的適宜血清條件,為進一步研究SKPs在生物材料上的生長分化奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 新生1 d SPF 級健康SD 大鼠,雌雄不限,由南通大學實驗動物中心提供。

1.2 材料與試劑 大藍閃蝶（Morpho menelaus，W.m.）和天堂鳳蝶（Papilio ulysses telegonus，P.u.t.）蝶翅購自北京雨瀟傳媒公司；杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DWEW）/F12 培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、胰酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于Gibco 公司。細胞活性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購于R&D 公司。

1.3 生物材料的處理和制備 蝶翅材料的處理同文獻[4],大藍閃蝶（W.m.）和天堂鳳蝶（P.u.t.）蝶翅分別經(jīng)1 mol/L HCl 室溫浸泡2 h,2 mol/L NaOH 溶液45 ℃浸泡過夜處理后,水洗至中性。75%乙醇浸泡消毒過夜,使用前以紫外照射15～30 min 滅菌,DWEW 至少浸泡1 h。

參照文獻[4]制備5%殼聚糖膜,攪拌24～36 h 后加入水楊酸（salicylic acid，SA）,攪拌至無氣泡,滴在經(jīng)滅菌處理的24 孔板圓玻片上,覆蓋不同規(guī)格（10、30、50 μm）的橡膠印章,自然風干后取下印章即制成不同規(guī)格的殼聚糖膜,以不覆蓋印章的殼聚糖平膜作為對照組。

1.4 大鼠SKPs 的體外分離培養(yǎng)與鑒定 參照J.BIERNASKIE 等[5-6]報道的方法,取新生1 d SD 大鼠背部皮膚約2 cm2,去除皮下組織,解剖液漂洗后剪碎,加入Ⅺ型膠原酶,37 ℃消化至組織呈云霧狀,加入清洗培養(yǎng)基終止消化；4 ℃1 200 r/min 離心5 min,棄上清,以清洗培養(yǎng)基重懸組織；用400 目篩網(wǎng)過濾,4 ℃下1 200 r/min 離心7 min 后棄上清,用含有40 ng/mL 堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、20 ng/mL 表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、2%B27 和0.1%青霉素-鏈霉素混合溶液P/S 的無血清培養(yǎng)基重懸,以5.0×104個/mL 接種培養(yǎng)2 d 后更換培養(yǎng)皿,每3 d加入1～2 mL 含足量因子的培養(yǎng)基或半量換液,培養(yǎng)至8 d 時,當細胞球的中心部位因為營養(yǎng)不足開始發(fā)暗或細胞球開始貼壁時便可傳代。采用免疫熒光化學染色鑒定細胞,倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 SKPs 與生物材料共培養(yǎng) 將處理好的蝶翅和殼聚糖膜移入超凈臺,75%乙醇浸泡過夜,雙蒸水漂洗材料,紫外光照消毒30 min,加入基礎培養(yǎng)基室溫過夜。將純化傳代后的P3 代SKPs 用800 r/min 離心6 min 后棄上清,加入SKPs 種植培養(yǎng)基,混勻后培養(yǎng)于蝶翅和殼聚糖膜各組材料表面。倒置顯微鏡下對蝶翅和殼聚糖膜各組材料表面生長的SKPs 觀察、拍照。

1.6 SKPs 在生物材料表面的細胞活力檢測 SKPs在蝶翅和殼聚糖膜表面培養(yǎng)4、24 和48 h 后,在不同時間點將10 μL CCK-8 溶液與10 μL 培養(yǎng)基混勻后加入SKPs-材料中,放入培養(yǎng)箱孵育4 h 后,吸取不同SKPs-材料的上清液100 μL/孔分別加入96孔板中,每組設3 個復孔,取出培養(yǎng)板,用酶標儀測量450 nm 處吸光度。

2 結(jié) 果

2.1 不同血清濃度培養(yǎng)條件對SKPs 在蝶翅材料上增殖生長的影響 從新生1 d 大鼠背部皮膚分離提取制備SKPs,培養(yǎng)24 h 后可見培養(yǎng)皿中有部分細胞貼壁,但大部分細胞為懸浮細胞。取上清換皿培養(yǎng)3 d 后可見細胞呈懸浮狀生長,大部分為小型細胞團,折光性強,傳代后的P3 代SKPs 經(jīng)細胞免疫熒光化學染色檢測,表達外胚層神經(jīng)干細胞標志物Nestin、中胚層間質(zhì)細胞標志物Vimentin 和Fibronectin、毛囊真皮乳頭真皮鞘標志物Versican,可與生物材料共培養(yǎng)。

將SKPs 在具有不同表面結(jié)構(gòu)形貌未包被促黏附試劑的兩種蝶翅材料上培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)SKPs 在兩種蝶翅材料表面均能黏附。CCK-8 法結(jié)果顯示,在含有1%FBS 培養(yǎng)基條件下,兩種蝶翅材料上培養(yǎng)4、24 h的SKPs 活力均顯著低于5%和10%FBS 培養(yǎng)基條件（P<0.05）,5%和10%條件下細胞活力差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,但5%FBS 條件下細胞活力略高（圖1）。培養(yǎng)48 h 后倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)1%FBS 培養(yǎng)基條件下,兩種蝶翅材料上均可見大量細胞碎片,細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡,細胞趨于裂解死亡。而5%和10%FBS 培養(yǎng)條件下兩種蝶翅材料上細胞均折光性強,輪廓清晰,可見明顯細胞突起,細胞生長情況良好。同時可見5%和10%FBS 培養(yǎng)條件下在大藍閃蝶（W.m.）蝶翅表面細胞突起均基本沿嵴紋方向伸展,細胞排列具有顯著的方向性；在天堂鳳蝶（P.u.t.）蝶翅表面細胞突起生長方向雜亂（圖2）。

圖1 SKPs 在蝶翅表面不同F(xiàn)BS 濃度條件下培養(yǎng)4、24 h 的細胞活力

圖2 SKPs 在蝶翅表面培養(yǎng)48 h 細胞形態(tài)觀察（Bar=20 μm）

2.2 不同血清濃度培養(yǎng)條件對SKPs 在殼聚糖膜材料上增殖生長的影響 仿生大藍閃蝶蝶翅表面拓撲結(jié)構(gòu),制備表面具有平行嵴紋結(jié)構(gòu)的殼聚糖膜材料,且調(diào)整嵴紋結(jié)構(gòu)尺寸,制作10、30 和50 μm 3 種不同寬度,采用殼聚糖平膜為對照。通過光學顯微鏡和掃描電鏡觀察,條紋穩(wěn)定并且互相平行,殼聚糖平膜表面光滑平整,無雜質(zhì)。

將SKPs 在4 種具有不同表面結(jié)構(gòu)形貌的殼聚糖膜材料（10、30、50 μm、平膜）上培養(yǎng),材料上均不包被促黏附試劑,結(jié)果顯示SKPs 在材料表面均能黏附。在含有1%FBS 培養(yǎng)基條件下SKPs 的活力均顯著低于5%和10%FBS 培養(yǎng)基（圖3）。培養(yǎng)48 h 后倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)1%FBS 培養(yǎng)基條件下,在4 種表面形貌殼聚糖膜上,細胞突起均回縮,細胞大多呈球形,細胞成團現(xiàn)象增多,可見大量細胞碎片,胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡,細胞趨于死亡。而5%和10%FBS 培養(yǎng)條件下細胞生長情況良好,呈散在分布,折光性強,輪廓清晰,出現(xiàn)較明顯的雙極或多極細胞突起,無明顯細胞碎片,尤其是表面具有10 μm嵴紋的殼聚糖模組,細胞數(shù)目較1%FBS 培養(yǎng)條件明顯增多,且細胞突起基本沿嵴紋方向伸展,細胞排列具有一定的方向性（圖4）。

圖3 SKPs 在殼聚糖膜表面不同F(xiàn)BS 濃度條件下培養(yǎng)4、24 和48 h 的細胞活力

圖4 SKPs 在具有不同表面結(jié)構(gòu)的殼聚糖膜表面培養(yǎng)48 h 細胞形態(tài)觀察（Bar=20 μm）

3 討 論

體外培養(yǎng)增殖是獲得足夠組織工程種子細胞的重要途徑。培養(yǎng)基中的血清可以提供細胞增殖生長所需的因子,供給細胞培養(yǎng)體系中合成培養(yǎng)基所缺乏的營養(yǎng)成分,在細胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用。但由于血清成分復雜,不同血清濃度可影響實驗結(jié)果[7-8]。

根據(jù)文獻[9]報道,SKPs 增殖與分化通常采用高濃度FBS（10%～15%）培養(yǎng)基條件。也有研究[10]報道低血清濃度培養(yǎng)體系能使表皮干細胞存活、快速增殖,并能很好地維持表皮干細胞的特性。本研究為探討材料表面結(jié)構(gòu)對SKPs 增殖分化影響,降低培養(yǎng)基中血清含量,檢測低于常規(guī)血清濃度培養(yǎng)基條件下細胞的生長狀況。

在使用經(jīng)酸堿處理過的天然蝶翅作為基質(zhì)材料培養(yǎng)細胞時,蝶翅材料上不需要包被促黏附試劑,SKPs 細胞在材料表面均能黏附。當采用不同的血清濃度培養(yǎng)條件時,發(fā)現(xiàn)在5%血清濃度條件下,細胞的增殖生長良好,與10%血清條件的細胞增殖率和生長形態(tài)相似,甚至略好；但血清濃度降至1%時,細胞增殖率顯著下降,與5%和10%的血清條件相比差異有統(tǒng)計學意義,細胞出現(xiàn)崩解死亡現(xiàn)象,表明過低的血清濃度培養(yǎng)條件可能不適宜細胞在生物材料上生長。同時結(jié)果還顯示,相同血清濃度培養(yǎng)條件下細胞的增殖差異無統(tǒng)計學意義,在兩種不同表面形貌蝶翅材料上生長,但細胞的突起生長方向差異明顯,與前期工作[4]中發(fā)現(xiàn)材料表面形貌對施萬細胞的影響相似,表明蝶翅材料表面結(jié)構(gòu)形貌可以調(diào)控多種細胞的定向運動遷移。

在仿生蝶翅表面結(jié)構(gòu)制備的殼聚糖膜材料上,采用不同的血清濃度條件培養(yǎng)SKPs,同樣可以發(fā)現(xiàn),較低血清濃度（5%）可以使細胞生長良好,但血清濃度過低（1%）則細胞存活增殖生長受損,與不同表面結(jié)構(gòu)的各種殼聚糖膜結(jié)果相似。

總之,本研究結(jié)果表明SKPs 在具有表面形貌的生物材料表面的增殖生長需要一定濃度的血清條件,為進一步探討SKPs 在具有表面形貌的生物材料表面的分化所需微環(huán)境等研究提供了實驗參考。