何美君，賈 博，白 光

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 沈陽 110847；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院，北京 100700；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110033）

隨著當(dāng)代社會的飛速發(fā)展，人們面對的各方面生活壓力隨之增加，近年來胃食管反流疾?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）和抑郁癥（depressive disorder）的發(fā)病率均有逐年增高的趨勢，且兩種疾病經(jīng)常相伴產(chǎn)生并互相影響[1]。GERD是指胃內(nèi)容物反流入食管造成黏膜損傷的疾病，伴有反酸、噯氣、咽喉異物感等癥狀，且常有患者發(fā)生焦慮、抑郁等精神心理異常[2]。抑郁癥是一種情緒障礙性疾病，以心情低落為主癥常伴隨一些胃腸功能紊亂的癥狀[3]。這兩種疾病都具有病程久、費(fèi)用高、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。有研究指出，伴有抑郁的人群患GERD的風(fēng)險(xiǎn)是健康人的1.7倍[4]。抑郁狀態(tài)可導(dǎo)致患者出現(xiàn)反酸、腹脹等一系列胃腸道神經(jīng)調(diào)節(jié)功能異常的表現(xiàn)，這些胃腸道癥狀又可以反過來加重患者的焦慮、抑郁情緒。如此惡性循環(huán)嚴(yán)重影響患者的健康。

半夏厚樸湯源自張仲景的《金匱要略》，是被歷代醫(yī)家常用的經(jīng)典方劑，具有疏肝、養(yǎng)血、健脾等功效。半夏厚樸湯在臨床中應(yīng)用廣泛，其在治療GERD、抑郁癥中療效顯著[5-6]?！爱惒⊥巍笔侵赴l(fā)病機(jī)制相同的不同疾病可以運(yùn)用同種治法。GERD和抑郁癥雖病名不同，疾病過程不同，但發(fā)病機(jī)制均與肝氣郁結(jié)密切相關(guān)。因此可以根據(jù)“異病同治”的原則，用半夏厚樸湯從肝論治此二病，施以疏肝理氣之法以奏調(diào)氣和血，解郁降逆之功。然而，半夏厚樸湯能夠發(fā)揮作用的具體細(xì)胞分子作用機(jī)制仍不明確。本研究擬運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間相互作用關(guān)系，從多角度探索中藥方劑的有效成分與機(jī)體生命活動的互作規(guī)律。深入探究半夏厚樸湯“異病同治”GERD和抑郁癥的分子機(jī)制，為新藥研發(fā)和擴(kuò)展臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 方 法

1.1 獲取半夏厚樸湯有效成分及靶點(diǎn) 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）檢索半夏厚樸湯中半夏、厚樸、茯苓、生姜、紫蘇5味中藥的所有化學(xué)成分。篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性指數(shù)（drug-like，DL）≥0.18的化合物及其作用靶點(diǎn)。

1.2 獲取半夏厚樸湯與胃食管反流病和抑郁癥的共有靶點(diǎn) 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫搜集GERD、抑郁癥的疾病靶點(diǎn)。對藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到半夏厚樸湯與GERD和抑郁癥的共有靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以“1.1”和“1.2”得到的化合物、靶點(diǎn)、疾病名作為節(jié)點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape3.6.0構(gòu)建“半夏厚樸湯-共有靶點(diǎn)-疾病（GERD/抑郁癥）”相互作用網(wǎng)絡(luò)模型。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 將“1.2”得到的半夏厚樸湯治療GERD和抑郁癥的共有靶點(diǎn)輸入至String網(wǎng)站構(gòu)建并繪制蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系圖（PPI），設(shè)置confidence score值為0.900，將PPI網(wǎng)絡(luò)以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape3.6.0進(jìn)行可視化處理。

1.5 生物學(xué)功能及通路富集分析 用R3.6.1對共有基因進(jìn)行基因本體分析（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）。

1.6 篩選通路的關(guān)鍵靶標(biāo) 將關(guān)鍵通路靶點(diǎn)分別導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫。用Cytoscape3.6.0軟件進(jìn)行Network Analysis網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯鶕?jù)度值（Degree）篩選出關(guān)鍵靶標(biāo)。

1.7成分-靶點(diǎn)分子對接 將“1.6”中分析得到的核心靶點(diǎn)與其對應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對接。在PubChem數(shù)據(jù)庫獲取化合物2D結(jié)構(gòu)并保存成SDF格式文件。用ChemOffice軟件修飾化合物的SDF格式文件，使自由能最小并保存成mol2的格式。在PDB數(shù)據(jù)庫檢索核心靶點(diǎn)并保存為pdb格式，運(yùn)用PyMOL軟件對受體進(jìn)行去除水、小分子配體的操作，再用AutoDock－Tools軟件為受體加氫，然后將配體和受體都轉(zhuǎn)化成pdbq的文件格式保存。最后運(yùn)用Auto Dock Vina對成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性進(jìn)行評價，并用PyMOL軟件可視化。

2 結(jié) 果

2.1 半夏厚樸湯中有效成分篩選及靶點(diǎn)的獲取 將半夏厚樸湯中半夏、厚樸、茯苓、生姜、紫蘇5味中藥上傳至TCMSP數(shù)據(jù)庫，按照OB≥30%且DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)篩選，半夏厚樸湯中含有49個活性化合物，去重后共獲得124個藥物作用靶點(diǎn)。（見表1）

表1 半夏厚樸湯相關(guān)化學(xué)成分

2.2 半夏厚樸湯治療GERD和抑郁癥的共有靶點(diǎn)獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫搜集GERD、抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)，獲得GERD靶點(diǎn)2 960個，抑郁癥10 105個。疾病靶點(diǎn)與半夏厚樸湯的124個作用靶點(diǎn)取交集，最后得到共有靶點(diǎn)有76個，并繪制Venn圖。（見圖1、表2）

表2 半夏厚樸湯與胃食管反流病、抑郁癥的交集靶點(diǎn)

圖1 半夏厚樸湯與胃食管反流病、抑郁癥靶點(diǎn)交集圖

2.3 半夏厚樸湯治療GERD及抑郁癥網(wǎng)絡(luò)圖 將“2.1”及“2.2”得到的有效成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0后，構(gòu)建“半夏厚樸湯-中藥-有效成分-‘GERD、抑郁癥’共有及各有靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。（見圖2）

圖2 半夏厚樸湯-有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 對共有靶點(diǎn)進(jìn)行分析 將76個共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建共有靶點(diǎn)間的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)。以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape，用“Network Analysis”功能計(jì)算各靶點(diǎn)度值（Degree），得到平均值為5.67。其中排在前3名的是蛋白分別是AKT1（Degree=20）、MAPK1（Degree=18）、JUN（Degree=17）。（見圖3）

圖3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 半夏厚樸湯與GERD和抑郁癥交集基因GO功能富集和KEGG通路富集分析

2.5.1 GO分析GO富集分析結(jié)果顯示，分子功能（molecular function，MF）19個，生物過程（biological process，BP）1個。主要包括G蛋白偶聯(lián)受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、類固醇激素受體活性、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、乙酰膽堿受體活性等。（見圖4）

圖4 交集靶點(diǎn)GO富集結(jié)果氣泡圖

2.5.2 KEGG分析 進(jìn)行KEGG信號通路富集分析獲得P<0.01的信號通路20條，說明半夏厚樸湯可能作用于PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1等信號通路中的某些因子從而發(fā)揮“異病同治”GERD和抑郁癥的作用。（見圖5）

圖5 交集靶點(diǎn)通路富集結(jié)果圖

2.5.3 關(guān)鍵通路中蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建并篩選關(guān)鍵靶點(diǎn) 為了深入探索重要通路中各作用靶點(diǎn)的互作關(guān)系，將PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1這4條信號通路的靶點(diǎn)分別導(dǎo)入String11.0數(shù)據(jù)庫，并用Cytoscape3.6.0軟件使結(jié)果可視化。節(jié)點(diǎn)為蛋白，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越鮮艷，則蛋白度值（Degree）越高。邊為蛋白間作用關(guān)系，線段越粗、顏色越鮮艷則其combine score值越高，作用關(guān)系更緊密。保留上述4條通路的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，根據(jù)度值對靶點(diǎn)進(jìn)行排序。結(jié)果顯示，滿足度值≥中值，且在通路中出現(xiàn)次數(shù)≥3次的靶點(diǎn)共有3個，分別是絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）。（見圖6）

圖6 重要通路的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.6 核心靶點(diǎn)蛋白受體與其對應(yīng)化合物的分子對接結(jié)果 將“2.5.3”中篩選得到的核心靶點(diǎn)MAPK1、AKT1、IL-6分別與其對應(yīng)的主要活性成分（包括木犀草素、β-胡羅卜素、黃芩素）進(jìn)行分子對接。且這3個化合物在網(wǎng)絡(luò)中的度值排在所有化合物的前5名，這表明它們可能作為藥物的關(guān)鍵活性成分在網(wǎng)絡(luò)中起重要作用。結(jié)合自由能是評價配體與受體的結(jié)合穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)。活性化合物和靶點(diǎn)蛋白受體間的結(jié)合活性度越高，則兩者結(jié)合能越低，當(dāng)結(jié)合能≤5.0 kcal/mol，則認(rèn)為分子與靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol，表示有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[7]。分子對接結(jié)果顯示，MAPK1、AKT1、IL-6與對應(yīng)化合物對接結(jié)合能均<-7.0 kcal/mol，這提示活性成分可以對核心靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控作用，為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。（見表4、圖7）

表4 重要靶點(diǎn)與其對應(yīng)化合物的結(jié)合能

圖7 分子對接展示圖

3 討 論

“異病同治”治法是中醫(yī)學(xué)辨證論治的精華，體現(xiàn)了中醫(yī)認(rèn)識疾病從整體出發(fā)的全局觀。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為GERD的總體病機(jī)為胃失和降，氣機(jī)上逆，故臨床常用疏肝和胃法來治療GERD[8]。而抑郁癥的病機(jī)多為肝氣郁滯，氣機(jī)不暢。熊霞軍等[9]通過數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對抑郁癥中醫(yī)證候頻數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛證為最常見的證型。情志不暢而肝氣郁結(jié)，機(jī)體氣機(jī)升降失調(diào)，或肝失疏泄而橫犯脾胃，最后都會導(dǎo)致中焦脾胃升降失衡，影響脾胃運(yùn)化功能。脾胃在病理狀態(tài)下又會滋生痰濁等病理產(chǎn)物，進(jìn)一步壅塞氣機(jī)，如此形成惡性循環(huán)。這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究認(rèn)為精神心理因素可通過腦-腸軸影響神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的平衡，同時胃腸道的癥狀也可通過腦-腸軸影響大腦的情感中樞引發(fā)心理障礙的觀點(diǎn)一致[10]。由此可見，治療GERD和抑郁癥的根本皆在于調(diào)和肝脾，即疏肝解郁，調(diào)達(dá)中焦脾胃氣機(jī)。

本研究為進(jìn)一步探究半夏厚樸湯“異病同治”GERD、抑郁癥的作用機(jī)制，應(yīng)用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法來分析其作用靶點(diǎn)和生物學(xué)功能。網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)半夏厚樸湯治療GERD和抑郁癥主要通過PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1等信號通路，且通路中的MAPK1、AKT1、IL-6這3個蛋白在網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用。

PI3K-AKT是細(xì)胞及個體生命活動中很重要的信號通路，是目前許多抗抑郁藥物發(fā)揮作用的通路之一。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是具有營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞作用的一種蛋白質(zhì)，對突觸可塑性有重要影響，與抑郁癥密切相關(guān)。研究表明，在大腦海馬特定區(qū)，BDNF水平降低導(dǎo)致體內(nèi)神經(jīng)元分化減少，進(jìn)而影響抑郁行為的發(fā)生[11]。PI3K-AKT通路激活后，通過調(diào)控下游BDNF等分子可調(diào)節(jié)突觸可塑性產(chǎn)生抗抑郁效果[12]。Barrett食管是食管內(nèi)黏膜屏障受損，柱狀上皮取代了鱗狀上皮所產(chǎn)生的病理變化，而GERD是其公認(rèn)的重要危險(xiǎn)因素。與正常食管和反流性食管炎相比，Barrett食管組織表皮生長因子受體（pidermal growth factor receptor，EGFR）、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B（erine-threonine protein kinase B，AKT）均明顯上調(diào)[13]。這提示PI3K-AKT信號通路可能參與Barrett食管的發(fā)生，或能成為防治Barrett食管的有效手段。

IL-17信號通路可通過調(diào)節(jié)免疫炎癥來影響GERD、抑郁癥。有研究發(fā)現(xiàn)，在反流性食管炎大鼠食管組織中IL-17蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對照組[14]。Th17細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，能特異性地分泌IL-17。抑郁狀態(tài)下小鼠腦內(nèi)IL-17浸潤增加，阻斷Th17細(xì)胞形成可提高小鼠抗抑郁能力[15]。

細(xì)胞凋亡在GERD和抑郁癥疾病進(jìn)展中起到重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)胃、十二指腸內(nèi)容物反流入食管引起黏膜損傷后，TNF-α、Caspase-3、Survivin等凋亡相關(guān)基因、蛋白的異常表達(dá)引起黏膜上皮細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致食管黏膜上皮損傷的主要原因[16]?，F(xiàn)有研究表明[17]，在抑郁癥疾病中小鼠的海馬里有明顯的神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生。

缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）對于維持機(jī)體對缺氧的適應(yīng)能力發(fā)揮了重要作用。HIF-1是一種異源二聚體，由α亞基和β亞基組成。HIF-1的調(diào)節(jié)亞基及活性亞基均為HIF-1α，因此它的生物活性由其α亞基實(shí)現(xiàn)。有動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α被激活時，BDNF和突觸后密度蛋白95（postsynaptic density protein95，PSD95）的表達(dá)增加，最終促進(jìn)海馬神經(jīng)元生長和突觸可塑性的增加，從而發(fā)揮抗抑郁作用[18]。HIF-1α還參與反流性食道炎組織黏膜修復(fù)與損傷過程，并發(fā)揮重要作用[19]。有研究發(fā)現(xiàn)半夏厚樸湯可能通過下調(diào)PPARγ、HIF-1α的表達(dá)，來改善食道黏膜炎癥狀態(tài)下的缺氧微環(huán)境，起到治療GERD的作用[20]。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了半夏厚樸湯治療GERD和抑郁癥的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系，富集分析發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)在PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1等信號通路中發(fā)揮著重要作用，為更深層次探討其作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。這與目前研究的GERD與抑郁癥在神經(jīng)生物學(xué)方面有諸多相似機(jī)制一致。抑郁癥可能會繼發(fā)于GERD，反過來又增加患者對反流癥狀的敏感性，因此深入探究兩病的共同病理機(jī)制具有必要性。本研究從微觀角度解釋了半夏厚樸湯可通過一些共同靶點(diǎn)異病同治GERD和抑郁癥，為臨床上合理應(yīng)用和新藥開發(fā)提供依據(jù)的同時，也豐富了“異病同治”的科學(xué)內(nèi)涵。