況云舒，詹雪冰，羅倩，董芳媛，孫恩濤，陳冰

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院病理教研室，安徽 蕪湖 241002；2. 皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球惡性腫瘤的第三大死亡原因，每年造成近74.5萬人死亡[1]。它通常發(fā)生在慢性肝病的背景下，尤其是肝硬化，因此限制了手術(shù)切除的可行性[2]。雖然早期局部治療方法有所改進(jìn)，但晚期患者的預(yù)后仍然很差。因此急需可靠的生物標(biāo)志物來預(yù)測HCC患者的預(yù)后并指導(dǎo)治療。利用數(shù)據(jù)庫挖掘?qū)ふ矣行У纳飿?biāo)志物并進(jìn)行功能驗(yàn)證已成為臨床研究的熱點(diǎn)之一。

ANKRD26編碼的蛋白質(zhì)，含有N末端的錨蛋白重復(fù)區(qū)域，在蛋白質(zhì)相互作用中起錨連作用[3]。該基因突變與常染色體顯性遺傳性血小板減少癥-2有關(guān)。在7號(hào)、10號(hào)、13號(hào)和16號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了該基因的假基因，已發(fā)現(xiàn)該基因編碼不同亞型的多種轉(zhuǎn)錄變體[4]。目前該基因的研究主要集中于血液系統(tǒng)疾病，如常染色體顯性遺傳性血小板減少癥的研究及脂肪代謝的研究，而在肝癌中的研究報(bào)道較少[5-6]。對其在肝癌預(yù)后中的功能的探究可能為我們提供新的生物標(biāo)志物。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫中的肝癌資料分析ANKRD26 mRNA在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，探討ANKRD26 mRNA表達(dá)量與生存預(yù)后之間的關(guān)系，并結(jié)合臨床資料構(gòu)建預(yù)后模型，同時(shí)，通過Human Protein Atlas(HPA)數(shù)據(jù)庫觀察ANKRD26蛋白的表達(dá)情況，并利用String數(shù)據(jù)庫分析與其相互作用的蛋白；此外通過CTD數(shù)據(jù)庫[7]探索與ANKRD26相互作用的化學(xué)物質(zhì)，從而為肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后評估和臨床診療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 ANKRD26 mRNA在33種腫瘤的表達(dá)和臨床資料整理 從TCGA數(shù)據(jù)庫(https：//portal.gdc.cancer.gov/)下載33種腫瘤的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和肝癌的臨床資料。利用Perl語言整理數(shù)據(jù)和提取ANKRD26 mRNA在33種腫瘤的表達(dá)量。再利用R語言中的ggpubr包生成ANKRD26 mRNA在33種腫瘤的表達(dá)的箱式圖。同時(shí)，利用Perl語言提取有完整臨床資料的肝癌病例234例，男性160例，女性74例，年齡17～85歲，平均年齡(57.05±13.24)歲。

1.2 基于Cox模型的單因素與多因素分析 通過R語言利用比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型(proportional hazards model，簡稱Cox模型)進(jìn)行單因素與多因素分析。提取臨床資料中的生存時(shí)間和生存狀態(tài)、分級、分期及T、M、N數(shù)據(jù)并與ANKRD26 mRNA結(jié)合在一起。利用R包(survival包)進(jìn)行單因素、多因素獨(dú)立預(yù)后分析并匯制森林圖。

1.3 預(yù)后模型的構(gòu)建生存曲線圖繪制 將單因素分析結(jié)果中P<0.05的ANKRD26的表達(dá)量、STAGE、T、M再次進(jìn)行Cox回歸分析，并根據(jù)ANKRD26的表達(dá)量和N值計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)，且依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)中值將234例肝癌病例分為低風(fēng)險(xiǎn)組與高風(fēng)險(xiǎn)組，并利用R包(survival包和survminer包)作生存曲線圖。

1.4 ROC曲線圖 基于上述風(fēng)險(xiǎn)公式與風(fēng)險(xiǎn)評分利用R包(survival ROC包)分別繪制1、3、5年的ROC曲線圖。

1.5 HumanProteinAtlas數(shù)據(jù)庫 HPA數(shù)據(jù)庫(https：//www.proteinatlas.org)提供24000種人類蛋白質(zhì)的組織和細(xì)胞分布信息，并免費(fèi)提供公眾查詢。搜索框搜索基因“ANKRD26”點(diǎn)選：①tissue；②cell；③pathology選項(xiàng)卡收集整理相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.6 KaplanMeier-plotter數(shù)據(jù)庫 KaplanMeier-plotter數(shù)據(jù)庫(http：//kmplot.com/analysis/)篩選方式：①條目：Liver cancer；②Genesymobol：ANKRD26；③分組：Auto select best cut off；④Survival：OS。

1.7 String數(shù)據(jù)庫 String數(shù)據(jù)庫(https：//www.string-db.org/)輸入“ANKRD26”：①物種：Homo sapiens；②置信度：medium confidence 0.400；③相互作用最大數(shù)：10。

1.8 The Comparative Toxicogenomics Database(CTD)數(shù)據(jù)庫 CTD數(shù)據(jù)庫(http：//ctdbase.org/)篩選方式：①選擇Chemical-Gene Interaction Query條目；②Chemical：equals空白；③Chemical-gene interaction：ANY；④Gene：equals，在彈出窗口輸入ANKRD26；⑤Organism：Homo sapiens。

2 結(jié)果

2.1 ANKRD26 mRNA在多種腫瘤組織中的表達(dá)情況 ANKRD26 mRNA在多種腫瘤中均有表達(dá)，與正常組織比較，其在乳腺癌、膽管癌、結(jié)腸癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗癌、胃癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)有差異性(P<0.05)；其中，與正常組織比較，肝癌組織中呈高表達(dá)(P<0.01)，見圖1。

注：ACC：腎上腺皮質(zhì)癌；BLCA：膀胱尿路上皮癌；BRCA：乳腺浸潤癌；CESC：宮頸鱗癌和腺癌；CHOL：膽管癌；COAD：結(jié)腸癌；DLBC：彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤；ESCA：食管癌；GBM：多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；HNSC：頭頸鱗狀細(xì)胞癌；KICH：腎嫌色細(xì)胞癌；KIRC：腎透明細(xì)胞癌；KIRP：腎乳頭狀細(xì)胞癌；LAML：急性髓細(xì)胞樣白血?。籐GG：腦低級別膠質(zhì)瘤；LIHC：肝細(xì)胞癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鱗癌； MESO：間皮瘤；OV：卵巢漿液性囊腺癌；PAAD：胰腺癌；PCPG：嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤；PRAD：前列腺癌；READ：直腸腺癌；SARC：肉瘤；SKCM：皮膚黑色素瘤；STAD：胃癌；TGCT：睪丸癌；THCA：甲狀腺癌；THYM：胸腺癌；UCEC：子宮內(nèi)膜癌；UCS：子宮癌內(nèi)瘤；UVM:葡萄膜黑色素瘤；*P<0.05，***P<0.01。

2.2 Cox回歸模型單因素與多因素分析結(jié)果 單因素分析結(jié)果顯示，ANKRD26 mRNA的表達(dá)量、臨床分期、腫瘤的大小、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是獨(dú)立的預(yù)后因子(P<0.05)；多因素分析結(jié)果顯示ANKRD26 mRNA的表達(dá)量是獨(dú)立的預(yù)后因子(P<0.05)，見圖2。

圖2 Cox回歸模型單因素與多因素分析圖

2.3 ANKRD26 mRNA的表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性 結(jié)果顯示，ANKRD26 mRNA的表達(dá)在年齡≤60歲組和>60歲組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同的分級水平有一定差異性，其中分級ANKRD26 mRNA的表達(dá)分級中StageⅠ和Ⅲ、StageⅡ和Ⅲ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 ANKRD26 mRNA的表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性

2.4 風(fēng)險(xiǎn)分組及生存分析 基于ANKRD26 mRNA的表達(dá)量及N值，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)，并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)的中位值，將234例肝癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組及低風(fēng)險(xiǎn)組，生存曲線提示低風(fēng)險(xiǎn)組具有更長的生存時(shí)間(P<0.05)，見圖4。

圖4 高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組生存時(shí)間比較

2.5 基于風(fēng)險(xiǎn)分組的ROC曲線 結(jié)果顯示，結(jié)合ANKRD26 mRNA的表達(dá)量及N值的風(fēng)險(xiǎn)分組，AUC值均>0.7，對于患者的預(yù)后評估有參考價(jià)值，見圖5。

2.6 KaplanMeier-plotter數(shù)據(jù)庫ANKRD26在肝癌患者中的生存曲線 基于KaplanMeier-plotter數(shù)據(jù)庫，分析364例肝細(xì)胞癌患者的生存資料，顯示ANKRD26表達(dá)水平對預(yù)后有顯著影響[HR=1.71(1.2～2.43)，P=0.0024]。ANKRD26表達(dá)量高的肝癌患者，總體生存時(shí)間相對更短，見圖6。

注：A：1年；B：3年；C：5年。

圖6 ANKRD26表達(dá)量與患者總體生存率生存曲線

2.7 ANKRD26在肝癌組織中蛋白層面的表達(dá)情況 對HPA數(shù)據(jù)庫中收集的免疫組織化學(xué)圖片進(jìn)行分析。結(jié)果顯示ANKRD26在肝細(xì)胞癌組織中的染色強(qiáng)度為中等，定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上，而其在正常肝組織中染色強(qiáng)度表現(xiàn)較弱，見圖7。

圖7 ANKRD26蛋白在肝癌中的表達(dá)情況

2.8 ANKRD26蛋白在肝癌組織中的分布情況 免疫熒光圖片中經(jīng)選擇“Anti-body”、“ER”、“Nucleus”選項(xiàng)，顯示ANKRD26主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，見圖8。

圖8 ANKRD26蛋白主要分布于胞質(zhì)

2.9 與ANKRD26相互作用的蛋白 相互作用的有：UBAP1、MASTL、GAS7、ETV6、SRP72、SBDS、SMC1B、SMC2、SMC4、SMC3。功能上主要有參與人體造血相關(guān)的有MASTL、GAS7、ETV6、SBDS，與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)維持有關(guān)的蛋白SMC1B、SMC2、SMC4、SMC3，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的SRP72以及參與蛋白質(zhì)降解的UBAP1，見圖9。

圖9 與ANKRD26相互作用的蛋白PPI圖

2.10 與ANKRD26有相互作用的化學(xué)物質(zhì) 刪除重復(fù)的化學(xué)物質(zhì)，共有26種化學(xué)物質(zhì)與ANKRD26有相互作用，有抑制ANKRD26表達(dá)作用的為benzamide、Aflatoxin B1、Atrazine、benzo(e)pyrene、butyraldehyde、Carbamazepine、Copper Sulfate、Cyclosporine、dicrotophos、dorsomorphin、Doxorubicin、K7174、Methapyrilene、methylmercuric chloride、p-Chloromercuribenzoic Acid、pentanal、perfluorooctane sulfonic acid、Plant Extracts、potassium chromate(VI)，有促進(jìn)ANKRD26表達(dá)作用的為Acetaminophen、Antirheumatic Agents、epigallocatechin gallate、pirinixic acid、Silicon Dioxide、Sunitinib、Vorinostat，見圖10。

3 討論

隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展，可以根據(jù)有效、特異性高且敏感的分子生物學(xué)標(biāo)志物將患者區(qū)分為不同類型，再根據(jù)不同的類型可以給予患者精準(zhǔn)治療，提高了患者的生存率，因此，尋找特異性、敏感性的生物學(xué)標(biāo)志物一直是研究的熱點(diǎn)[8-9]。利用AFP或APFmRNA檢測有可能預(yù)測肝癌的浸潤和轉(zhuǎn)移，但對于AFP陰性者，目前尚無可靠敏感的預(yù)測指標(biāo)。因此，積極尋找高敏感且與預(yù)后臨床指標(biāo)密切相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物可能為AFP陰性者提供有效地預(yù)測。ANKRD26基因最初被鑒定為靈長類動(dòng)物特定的祖先ANKRD30A和POTE基因家族，它映射到10p12.1染色體，編碼192 kDa的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)位于質(zhì)膜的內(nèi)部附近[10]。ANKRD26蛋白包含兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：錨蛋白重復(fù)序列(位于74-199位氨基酸)和螺旋區(qū)，已知這兩個(gè)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，表明其可能起銜接蛋白的作用[11]。目前，ANKRD26相關(guān)研究仍局限在血液相關(guān)及脂肪代謝相關(guān)的疾病為主[12]。目前對于其在肝細(xì)胞癌中的研究則罕見報(bào)道。

注：綠色為抑制，紅色為促進(jìn)。

本研究中基于Cox回歸模型進(jìn)行獨(dú)立的單因素與多因素分析均顯示，ANKRD26是獨(dú)立的預(yù)后因子，提示ANKRD26表達(dá)量的檢測可作為肝癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。而且結(jié)合臨床上的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行分組后，顯示ANKRD26高表達(dá)和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞患者可能預(yù)后較差。而且利用KaplanMeier-plotter數(shù)據(jù)庫的生存曲線亦驗(yàn)證了ANKRD26高表達(dá)是肝細(xì)胞癌患者總生存期更短。ANKRD26的表達(dá)在年齡上具有差異，提示對于>60歲的患者更應(yīng)檢測ANKRD26的表達(dá);而且，分級中StageⅠ和Ⅲ、StageⅡ和Ⅲ亦有差異，提示ANKRD26的表達(dá)可作為臨床分組的參考指標(biāo)。

通過HPA等數(shù)據(jù)庫挖掘，發(fā)現(xiàn)ANKRD26在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)量顯著升高，提示其可能是促癌基因，若能開發(fā)出抑制ANKRD26表達(dá)的藥物，對肝癌的治療可能有新的改觀。

與ANKRD26相互作用蛋白主要是造血、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與蛋白降解相關(guān)的蛋白。所以ANKRD26可能參與了造血系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生，因而目前大多數(shù)研究集中在這一方面。但其參與蛋白降解以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程，目前報(bào)道較少，因此研究其中具體機(jī)制可能有助于理解其在腫瘤中的分子機(jī)制，為其在肝細(xì)胞癌的研究提供了新的方向。

本研究結(jié)果顯示，ANKRD26蛋白主要定位于胞質(zhì)中，且在肝細(xì)胞癌組織的染色強(qiáng)度與正常肝組織染色強(qiáng)度有著明顯的差異。依據(jù)364例患者生存分析結(jié)果，顯示ANKRD26表達(dá)量與肝細(xì)胞癌患者總體生存時(shí)間具有明顯的相關(guān)性，提示后續(xù)可進(jìn)一步研究與開發(fā)，根據(jù)ANKRD26表達(dá)量的水平來判斷肝癌患者的預(yù)后。

我們探索ANKRD26和現(xiàn)有化學(xué)物質(zhì)之間相互作用的潛在信息后，發(fā)現(xiàn)多種化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)影響其表達(dá)水平。其中起到促進(jìn)ANKRD26表達(dá)的有7種，肝細(xì)胞癌的患者應(yīng)避免接觸或應(yīng)用這7種化學(xué)物質(zhì)/藥物。而起到抑制ANKRD26表達(dá)作用的有19種，其中苯并芘、黃曲霉素B1等是我們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到的引起腫瘤的危險(xiǎn)因素，因此在開發(fā)藥物時(shí)，不能只考慮到對ANKRD26的抑制作用，更需要從長遠(yuǎn)的角度來衡量患者的受益情況。所以更需要注意的是，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來支持具有ANKRD26過度表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者能否受益于ANKRD26的被抑制；而且具體的藥物機(jī)制和毒理，仍需大量的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。綜上所述，ANKRD26在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，且與患者的生存有一定的關(guān)系，因此，進(jìn)一步深入研究可能為患者預(yù)后評估提供新的檢測指標(biāo)。但其和AFP表達(dá)有無相關(guān)性及其在生物學(xué)功能的研究還有待于從臨床標(biāo)本、細(xì)胞水平、動(dòng)物水平等方面進(jìn)一步研究。同時(shí)，闡明ANKRD26蛋白在肝細(xì)胞癌的發(fā)生中的分子作用機(jī)制，也會(huì)為臨床的診療提供新的思路和新的分子生物學(xué)標(biāo)志。