楊淋凱，朱小芳，錢秀娟，劉衛(wèi)紅，姜紅霞，劉長仲

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省植保植檢站，甘肅 蘭州 730020）

草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)屬鱗翅目夜蛾科灰翅夜蛾屬[1-3]，是一種原發(fā)生于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)的多食性及遷飛性農(nóng)業(yè)害蟲，因其生存能力強(qiáng)，擴(kuò)展速度快，目前已侵入非洲和亞洲多個(gè)國家和地區(qū)[4]。我國于2019 年1 月在云南首次發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾，此后迅速蔓延至多個(gè)省份。甘肅省于2019年7 月2 日首次發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾，截止2019 年年底已在甘肅東部28 個(gè)縣區(qū)發(fā)生，為害玉米(Zea mays)約266.67 hm2[5-6]。有研究證明入侵我國的草地貪夜蛾均為“玉米型”[7]，主要危害玉米，其次是高粱(Sorghum bicolor)、谷子(Setaria italica)、小麥(Triticum aestivum)、甘蔗(Saccharum officinarum)等15 種作物，甚至也能在皇竹草(Pennisetum sinese)、馬唐(Digitaria sanguinalis)、牛筋草(Eleusine indica)、蘇丹草(Sorghum sudanense)等禾本科草類植物上生存[8]。玉米是我國主要的糧食和飼料作物，而高粱的營養(yǎng)成分類似于玉米，且成本更低，經(jīng)加工可做成優(yōu)良的飼料，減緩草地畜牧業(yè)飼草供應(yīng)緊缺的壓力[9]。玉米和高粱是草地貪夜蛾的主要寄主，其大規(guī)模危害會(huì)造成玉米和高粱的嚴(yán)重減產(chǎn)，這無疑對(duì)糧食安全生產(chǎn)和草地畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成了極大威脅。目前國內(nèi)對(duì)該害蟲的防治以幾種殺蟲活性強(qiáng)的新型化學(xué)殺蟲劑為主，如甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氯蟲苯甲酰胺、乙基多殺菌素及相關(guān)的復(fù)合制劑，并在生產(chǎn)上取得了一定的防治效果[10-12]，但長期大量施用化學(xué)農(nóng)藥不僅污染環(huán)境、害蟲容易產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)還增加了飼料農(nóng)藥超標(biāo)和畜產(chǎn)品品質(zhì)下降的風(fēng)險(xiǎn)。在生物防治方面，草地貪夜蛾也已經(jīng)對(duì)轉(zhuǎn)Bt 毒蛋白基因的作物及Bt 殺蟲制劑產(chǎn)生抗性[13]，因此尋求新的生防制劑具有重要的意義。

昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematodes, EPN)包括斯氏屬(Steinernema)和異小桿屬(Heterorhabditis)兩類[14]，具有寄主范圍廣及主動(dòng)搜尋能力、對(duì)環(huán)境無污染、對(duì)人畜安全、易培養(yǎng)、成本低、可與農(nóng)藥混配施用等優(yōu)點(diǎn)[15]。作為重要的生防資源，昆蟲病原線蟲已被用于防治蠐螬(Scarabacidae)、韭蛆(Bradysia odoriphaga)、小地老虎(Agrotis ypsilon)等多種農(nóng)林、草地、花卉以及衛(wèi)生害蟲[16-17]。使用昆蟲病原線蟲防控草地貪夜蛾已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。昆蟲病原線蟲對(duì)寄主昆蟲有很強(qiáng)的?；?，不同種類甚至品系對(duì)相同寄主的致病力不同[18]，因此正確選擇適宜種類及品系是防治成功的重要因素。

甘肅氣候干燥，少雨且晝夜溫差大，外地引進(jìn)的昆蟲病原線蟲難以適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境，而土著昆蟲病原線蟲早已適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臈l件。因此，應(yīng)用土著昆蟲病原線蟲具有短時(shí)間內(nèi)完成定殖、建立穩(wěn)定種群、更好地發(fā)揮持續(xù)高效控害等特點(diǎn)。為探索甘肅省昆蟲病原線蟲資源對(duì)防控草地貪夜蛾的潛力，拓展其在害蟲生物防治中的應(yīng)用，本研究利用從甘肅省采集分離獲得的5 種10 個(gè)昆蟲病原線蟲品系，通過室內(nèi)生物測定，篩選出對(duì)草地貪夜蛾具有高效生防潛力的昆蟲病原線蟲品系，為有效利用甘肅省昆蟲病原線蟲資源防治草地貪夜蛾提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx：草地貪夜蛾采自甘肅省白銀市靖遠(yuǎn)縣，在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

供試線蟲：夜蛾斯氏線蟲(Steinernema feltiae)0639C、0657YM、0661YM、0663PG、0663TD、0619HT品系，斯氏線蟲(Steinernema karil) 0663YC 品系，卡森斯氏線蟲(Steinernema krussei) 0657L 品系，短尾異小桿線蟲(Heterorhabditis brevicaudis) 0641TY 品系，大異小桿線蟲(Heterorhabditis megidis) 0627M 品系。線蟲10 個(gè)品系均采自甘肅省內(nèi)西峰市、天水市、武威市民勤縣、白銀市靖遠(yuǎn)縣和景泰縣等具有代表性的市縣[18]，采用大蠟螟(Galleria mellonella)誘集法分離并收集線蟲[19]，經(jīng)品系鑒定后保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)實(shí)驗(yàn)室。定期以韭蛆(Bradysia odoriphaga)為寄主于無菌土壤中復(fù)壯以保證品系活力。試驗(yàn)所用線蟲懸浮液為新鮮培養(yǎng)，由大蠟螟活體擴(kuò)繁而得，保存于4 ℃冰箱內(nèi)待用。

1.2 致病力測定

以草地貪夜蛾2 齡幼蟲作為供試?yán)ハx，篩選出致病力較高的昆蟲病原線蟲種類和品系，用致病力較高的昆蟲病原線蟲侵染草地貪夜蛾，并測定其對(duì)草地貪夜蛾的致病力。

1.2.1 甘肅省昆蟲病原線蟲種類(品系)篩選

在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中處理，每個(gè)孔加入1 頭草地貪夜蛾2 齡幼蟲并用脫脂棉和濾紙進(jìn)行保濕，12 個(gè)孔為一個(gè)處理，用移液槍吸取200 頭線蟲侵染的溶液滴加在每個(gè)孔內(nèi)，1 個(gè)品系線蟲為1 個(gè)處理，共10 個(gè)線蟲處理，同時(shí)以等量無菌水作對(duì)照，每處理重復(fù)3 次，孔板內(nèi)放置足量的草地貪夜蛾人工飼料[20]。然后將24 孔板放回人工氣候箱，每隔12 h 檢查草地貪夜蛾的死亡情況并記錄?？刂茥l件為溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度70%，光照 ∶ 黑暗16 h ∶ 8 h。

1.2.2 高效昆蟲病原線蟲品系對(duì)草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致病力測定

對(duì)篩選出的高效品系進(jìn)行致病力測定，在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中處理，每個(gè)孔加入1 頭草地貪夜蛾2 齡幼蟲并用脫脂棉和濾紙保濕，12 個(gè)孔為一個(gè)處理。每種線蟲設(shè)6 個(gè)數(shù)量梯度，使線蟲與草地貪夜蛾2 齡幼蟲數(shù)量比分別為5 ∶ 1、10 ∶ 1、20 ∶ 1、40 ∶ 1、80 ∶ 1、160 ∶ 1，同時(shí)以等量無菌水處理作對(duì)照，每處理重復(fù)3 次，孔板內(nèi)放置足量的草地貪夜蛾人工飼料。然后將24 孔板放回人工氣候箱，每隔12 h 檢查草地貪夜蛾的死亡情況并記錄?？刂茥l件為溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度70%，光照 ∶ 黑暗16 h ∶ 8 h。

1.2.3 高效昆蟲病原線蟲品系對(duì)草地貪夜蛾預(yù)蛹的致病力測定

在9 cm 的培養(yǎng)皿中墊2 層濾紙，加入適量蒸餾水保持濕潤，每皿放入1 頭草地貪夜蛾預(yù)蛹，設(shè)200、400、800、1 600、3 200 IJs·H?15 個(gè)線蟲數(shù)量梯度，用移液槍吸取各濃度的線蟲直接滴加到預(yù)蛹體壁上，每處理10 頭，3 次重復(fù)，以無菌水處理作對(duì)照。然后將培養(yǎng)皿放回人工氣候箱，檢查化蛹情況并記錄。

1.2.4 高效昆蟲病原線蟲品系對(duì)草地貪夜蛾蛹的致病力測定

在帶蓋的小塑料盒內(nèi)裝入適量蛭石并加蒸餾水保持濕潤，每個(gè)盒子中埋入1 頭正常化蛹的供試?yán)ハx蛹，用移液槍滴加各梯度的線蟲，使線蟲與草地貪夜蛾蛹的數(shù)量比分別為800 ∶ 1、1 600 ∶ 1、3 200 ∶ 1、6 400 ∶ 1、12 800 ∶ 1，每處理10 頭，3 次重復(fù)，以無菌水處理作對(duì)照，操作完成后放回人工氣候箱觀察羽化情況并記錄。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0 軟件對(duì)所測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果。使用 One-Sample Kolmogorov-Smirnov test 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的使用 Lev-ene’s test 進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若齊性不存在，則對(duì)百分率數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。對(duì)本試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)表明均符合方差齊性，直接進(jìn)行單因素方差分析，并使用 LSD test 進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘肅省昆蟲病原線蟲優(yōu)良種類(品系)的篩選

不同昆蟲病原線蟲種類間對(duì)草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致死率差異較大(表1)，夜蛾斯氏線蟲對(duì)草地貪夜蛾2 齡幼蟲致病力最強(qiáng)，卡森斯氏線蟲次之。幼蟲被昆蟲病原線蟲各品系侵染24 h 后均有一定的死亡率，其中夜蛾斯氏線蟲0663PG 為63.90%，顯著高于其他昆蟲病原線蟲種類(P< 0.05)。夜蛾斯氏線蟲的0657YM、0663TD、卡森斯氏線蟲0657L 和斯氏線蟲(S. karil) 0663YC 的致病死亡率在31%～43%，但其間差異不顯著(P> 0.05)。侵染48 h 后，各品系對(duì)寄主的致死作用均有所增加，其中夜蛾斯氏線蟲 0663PG 為88.90%，與其他昆蟲病原線蟲種類存在顯著差異(P< 0.05)。侵染72 h 后，除夜蛾斯氏線蟲0619HT 和短尾異小桿線蟲0641TY 外，其余所有昆蟲病原線蟲品系的累積死亡率均在50%以上。大異小桿線蟲 0627M 和夜蛾斯氏線蟲0663TD的致死率為75%和72.23%，兩者間差異不顯著(P>0.05)。夜蛾斯氏線蟲 0663PG 和卡森斯氏線蟲 0657L的致死率分別達(dá)到100%和83.30%，兩者間差異不顯著(P> 0.05)?？梢?，夜蛾斯氏線蟲 0663PG 和卡森斯氏線蟲0657L 為對(duì)草地貪夜蛾幼蟲致病力較強(qiáng)的昆蟲病原線蟲品系。

表1 10 個(gè)昆蟲病原線蟲品系對(duì)草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致病力Table 1 Virulence of 10 entomopathogenic nematodes strains on 2nd instar larvae of S. frugiperda

夜蛾斯氏線蟲的不同品系對(duì)草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致死率存在明顯差異。在夜蛾斯氏線蟲的6 個(gè)供試品系中，侵染24 h 后，0663PG 的致死率為63.90%，與其余品系之間存在顯著差異(P< 0.05)。侵染72 h 后，0663PG 的累計(jì)死亡率達(dá)到100%，0663TD、0657YM、0639C、0661YM 和0619HT 分 別為75.00%、63.90%、55.57%、55.57%和30.53%。

2.2 2 種高效昆蟲病原線蟲對(duì)草地貪夜蛾的致病力

草地貪夜蛾2 齡幼蟲被侵染24 h 后，夜蛾斯氏線蟲0663PG 與幼蟲數(shù)量比為160 ∶ 1 和80 ∶ 1 時(shí)，其致死率均為38.90%，顯著高于其他線蟲濃度(P<0.05)。侵染48 h 時(shí)，數(shù)量比為160 ∶ 1 和80 ∶ 1 時(shí)死亡率分別為63.90%和52.77%，兩者差異不顯著(P>0.05)。侵染72 h 時(shí)，其死亡率分別達(dá)到100%和61.10%，兩者間存在顯著差異(P< 0.05)，也顯著高于其他線蟲濃度(P< 0.05) (表2)。

卡森斯氏線蟲0657L 侵染24 h 后，數(shù)量比為160 ∶ 1 和80 ∶ 1 時(shí)，其致死率均為27.77%。侵染48 h后，數(shù)量比為160 ∶ 1 和80 ∶ 1 死亡率較高，分別為61.10%和50.57%；處理72 h 后其死亡率分別為80.53%和58.33%，兩者間差異顯著(P< 0.05) (表2)。

表2 夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系和卡森斯氏線蟲0657L 品系對(duì)草地貪夜蛾 2 齡幼蟲的致死作用Table 2 Steinernema feltiae 0663PG and Steinernema krussei 0657L against Spodoptera frugiperda 2nd instar larvae

2.3 夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系對(duì)草地貪夜蛾預(yù)蛹的致病力測定

5 個(gè)數(shù)量梯度處理下的預(yù)蛹2 d 后均可成功化蛹，侵染13 d 后處理組和對(duì)照組開始出現(xiàn)草地貪夜蛾蛹羽化，處理15 d 后，夜蛾斯氏線蟲0663PG 與草地貪夜蛾預(yù)蛹數(shù)量比為1 600 ∶ 1 和3 200 ∶ 1 時(shí)，蛹的羽化率為96.67%，其余梯度處理下的羽化率均為100% (表3)。

表3 夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系對(duì)草地貪夜蛾預(yù)蛹的致病力Table 3 Steinernema feltiae 0663PG against Spodoptera frugiperda prepupa

2.4 夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系對(duì)草地貪夜蛾蛹的致病力測定

5 個(gè)數(shù)量梯度下夜蛾斯氏線蟲0663PG 在侵染13 d 后對(duì)草地貪夜蛾蛹的致死作用不明顯，數(shù)量比為6 400 ∶ 1 和12 800 ∶ 1 時(shí)，蛹的羽化率為93.33%。對(duì)未羽化的蛹解剖發(fā)現(xiàn)確有線蟲寄生，但各梯度下的線蟲對(duì)蛹的致死率低于10%。觀察結(jié)果表明，昆蟲病原線蟲不適合在蛹期進(jìn)行防治，且線蟲對(duì)草地貪夜蛾蛹的羽化時(shí)間并沒有影響(表4)。

表4 夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系對(duì)草地貪夜蛾蛹的致病力Table 4 Steinernema feltiae 0663PG against Spodoptera frugiperda pupa

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系對(duì)草地貪夜蛾的致病力較高，處理48 h 時(shí)，侵染數(shù)量比為160 ∶ 1 時(shí)，其死亡率達(dá)到63.90%。梁銘榮等[21]研究發(fā)現(xiàn)，小卷蛾斯氏線蟲AⅡ和長尾斯氏線蟲X-7品系處理36 h 時(shí)，侵染數(shù)量比為50 ∶ 1 時(shí)，對(duì)草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致死作用達(dá)到92%和80%。通過結(jié)果比對(duì)分析，夜蛾斯氏線蟲0663PG 致病力低于小卷蛾斯氏線蟲AⅡ和長尾斯氏線蟲X-7 品系，說明不同種類及品系對(duì)同一種寄主昆蟲的致病力存在差異。這可能與不同種間線蟲的侵染方式有關(guān)，夜蛾斯氏線蟲0663PG 屬于中間型線蟲[22]，而小卷蛾斯氏線蟲AⅡ和長尾斯氏線蟲X-7 品系屬于伏擊型侵染策略的線蟲，草地貪夜蛾2 齡幼蟲比較活躍，行動(dòng)速度快，更適合伏擊型線蟲侵染。錢秀娟等[23]在室內(nèi)測定下，夜蛾斯氏線蟲0619HT 對(duì)大蠟螟的致死作用最強(qiáng)，處理72 h 時(shí)，侵染數(shù)量比為60 ∶ 1 時(shí)，累計(jì)死亡率為96.7%。而本研究發(fā)現(xiàn)，0619HT在處理72 h 時(shí)，侵染數(shù)量比為200 ∶ 1 時(shí)，累計(jì)死亡率為30.53%，與供試的其他9 個(gè)線蟲品系相比致病力最低，說明同種昆蟲病原線蟲品系對(duì)不同的寄主昆蟲致病力存在差異。昆蟲病原線蟲的致病力會(huì)因寄主昆蟲的改變而不同，因此，昆蟲病原線蟲的室內(nèi)篩選和致病力評(píng)價(jià)在生產(chǎn)應(yīng)用之前很有必要。

國外對(duì)于昆蟲病原線蟲防控草地貪夜蛾的研究早于國內(nèi)，許多研究表明昆蟲病原線蟲具有防治草地貪夜蛾的應(yīng)用潛力。Lezama-Gutierrez 等[24]和Molina-Ochoa 等[25]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，斯氏線蟲是土壤中分布最廣的草地貪夜蛾天然病原物。Andaló等[26]在室內(nèi)條件下測定了17 個(gè)巴西本地線蟲品系對(duì)草地貪夜蛾的致病力, 最終得到S. arenarium和Heterorhabditissp. RSC02 兩個(gè)高效品系。本研究以甘肅本地10 個(gè)昆蟲病原線蟲品系進(jìn)行室內(nèi)篩選和致病力評(píng)測，發(fā)現(xiàn)夜蛾斯氏線蟲0663PG 的毒力最高，當(dāng)0663PG 與草地貪夜蛾數(shù)量比為80 ∶ 1 時(shí)，72 h 后草地貪夜蛾幼蟲死亡率在60%以上，當(dāng)侵染劑量增加到160 ∶ 1時(shí)，草地貪夜蛾的死亡率達(dá)到100%，本研究認(rèn)為，夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系在草地貪夜蛾的生物防治方面有著巨大潛力，可以在后續(xù)研究中與化學(xué)藥劑組合使用，彌補(bǔ)線蟲單獨(dú)使用時(shí)見效慢的缺陷[27]?；诖耍瑢で蟾咝У投镜臍⑾x劑與夜蛾斯氏線蟲0663PG 混配防治草地貪夜蛾還有待研究。

本研究在室內(nèi)測定了甘肅省5 種10 個(gè)線蟲品系對(duì)草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致病力，篩選出致病力較好的夜蛾斯氏線蟲0663PG 和卡森斯氏線蟲0657L 兩個(gè)品系。在低劑量下對(duì)以上2 種線蟲進(jìn)行致病力測定，夜蛾斯氏線蟲0663PG 與草地貪夜蛾數(shù)量比為160 ∶ 1 時(shí)，處理48 h 后致死率為63.90%，與卡森斯氏線蟲0657L 的致死率相近，但處理72 h后草地貪夜蛾2 齡幼蟲死亡率達(dá)到100%，同樣數(shù)量比下卡森斯氏線蟲0657L 對(duì)2 齡幼蟲的致死率為80%，夜蛾斯氏線蟲0663PG 的致病力高于卡森斯氏線蟲0657L。在大劑量下用夜蛾斯氏線蟲0663PG侵染草地貪夜蛾預(yù)蛹和蛹，預(yù)蛹在線蟲處理下2 d后成功化蛹，預(yù)蛹和蛹分別在侵染15 d 和13 d 后完成羽化，但夜蛾斯氏線蟲0663PG 對(duì)預(yù)蛹和蛹的致死率低于10%。本研究結(jié)果表明，草地貪夜蛾預(yù)蛹和蛹對(duì)昆蟲病原線蟲不敏感，線蟲侵染后對(duì)蛹的羽化時(shí)間沒有顯著影響(P> 0.05)，故昆蟲病原線蟲并不適合在草地貪夜蛾預(yù)蛹和蛹期進(jìn)行防治。