劉夢超,王明哲,肖 遙,沈 存,王夢迪,趙文景
(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010;2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100010)
腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是大多數(shù)慢性腎臟疾病的共同途徑,以成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)過度沉積為主要病理特征,在腎臟結(jié)構(gòu)和功能的逐步喪失中起重要作用。無論是腎小球疾病、腎小管間質(zhì)病變還是腎血管疾病,其腎功能損害的程度都與RIF密切相關(guān)[1-2]。腎間質(zhì)纖維化程度也被認(rèn)為是預(yù)后指標(biāo)和治療指導(dǎo)之一,然而目前在RIF的防治方面尚缺乏有效的措施。
中醫(yī)藥治療RIF具有一定優(yōu)勢?!澳I絡(luò)癥瘕”理論[3-4]是王耀獻(xiàn)以絡(luò)病學(xué)說、癥瘕理論、腎臟病理研究為基礎(chǔ),由呂仁和糖尿病腎病“腎絡(luò)微型癥瘕”理論發(fā)展推進(jìn)而成,已形成理、法、方、藥較完備的中醫(yī)藥治療慢性腎臟疾病的理論體系。該理論認(rèn)為慢性腎臟疾病的主要病機(jī)是腎疾日久,失治誤治,“腎絡(luò)徵瘕”形成,終致腎用失司,濕濁瘀毒潴留。聚散消長是“腎絡(luò)癥瘕”理論的核心病機(jī),持續(xù)的聚散失衡,腎絡(luò)痰濕、瘀血、瘀毒漸聚膠結(jié),即成“腎絡(luò)癥瘕”,與RIF的病理發(fā)展過程相符合。
王耀獻(xiàn)教授提倡應(yīng)用消癥散結(jié)法,常用腎炎防衰液治療RIF[5]。腎炎防衰液由黃芪、當(dāng)歸、海藻、熟地黃、大黃組成,有補(bǔ)氣扶正、消癥散結(jié)之功,經(jīng)多年臨床證實其療效確切。前期臨床試驗提示腎炎防衰液可延緩CKD5期非透析患者的首次進(jìn)入透析時間,減少CKD5期患者透析事件發(fā)生率[6];多項針對單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)誘導(dǎo)的RIF大鼠模型的實驗研究顯示,腎炎防衰液對RIF具有抑制炎癥、減少細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)積聚等作用[7-8],但其具體機(jī)制尚未完全探明。因此,本研究通過可體現(xiàn)中醫(yī)藥多成分、多靶點、多途徑的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,探尋腎炎防衰液治療RIF的具體機(jī)制,以期為進(jìn)一步的研究提供思路和依據(jù)。
1.1 腎炎防衰液有效成分及作用靶點的篩選 以“黃芪”“當(dāng)歸”“海藻”“熟地黃”“大黃”為檢索詞,通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)檢索腎炎防衰液的化學(xué)成分,根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18進(jìn)行篩選,獲取腎炎防衰液的活性成分,并在該數(shù)據(jù)庫查詢這些成分的對應(yīng)靶點。另以“HUANG QI”“DANG GUI”“HAI ZAO”“DI HUANG”“SHU DI HUANG”“DA HUANG”為關(guān)鍵詞,于BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.Ncpsb.org/batman-tcm/)以“P<0.05且Score cutoff≥39”為標(biāo)準(zhǔn)篩選腎炎防衰液的有效成分及作用靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對靶點信息進(jìn)行規(guī)范化處理。將上述篩選后的成分與靶點合并后去除重復(fù)項,建立“中藥-成分-靶點”數(shù)據(jù)庫。
1.2 RIF作用靶點的獲取 以“renal interstitial fibrosis”為關(guān)鍵詞,應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)、DisGeNET平臺(https://www.disgenet.org/home/)獲取RIF相關(guān)靶點,利用UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行規(guī)范化處理,合并后去掉重復(fù)項,獲得RIF作用靶點。
1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
1.3.1 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將“1.1”項中獲取的成分靶點與“1.2”項中的RIF作用靶點通過韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集,獲得共有靶點,即腎炎防衰液治療RIF的潛在作用靶點。將其導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫,限定物種為“Homo Sapiens”,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),然后將該文件導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行分析,獲得核心靶點。
1.3.2 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將共有靶點與其對應(yīng)中藥成分通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò),利用“Network analyze”功能進(jìn)行分析,并通過該軟件的Centiscape插件根據(jù)自由度篩選出網(wǎng)絡(luò)中的核心成分。
1.3.3 “中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于“1.3.2”項的“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò),與RIF、疾病靶點、中藥關(guān)聯(lián),應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件繪制“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析。
1.4 京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 通過Cytoscape3.7.2的Clue GO 2.5.4插件對共有靶點進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析,獲取腎炎防衰液治療RIF的主要通路。
1.5 分子對接預(yù)測 通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載核心成分的mol2格式,通過Chem3D對所下載的化合物進(jìn)行能量最小化,并轉(zhuǎn)化為pdb格式;通過PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)下載自由度前5位核心靶點的晶體結(jié)構(gòu)PDB格式文件。采用AutoDock Tools-1.5.6軟件對上述文件進(jìn)行常規(guī)處理,將處理后的化合物作為小分子配體,5種蛋白靶點作為受體,根據(jù)小分子與靶點的作用位點確定的Grid Box的中心位置以及長寬高,最后通過AutoDock vina和python腳本進(jìn)行批量對接,對分子對接結(jié)果進(jìn)行分析,化合物與蛋白的結(jié)合作用可視化采用Pymol軟件。
2.1 藥物成分篩選與潛在作用靶點的獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫與BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選,獲得黃芪的活性成分38個,當(dāng)歸的活性成分124個,海藻的活性成分5個,熟地黃的活性成分5個,大黃的活性成分28個,總計200個。黃芪的潛在作用靶點253個,當(dāng)歸的潛在作用靶點468個,海藻的潛在作用靶點100個,熟地黃的潛在作用靶點94個,大黃的潛在作用靶點249個,總計1 164個。5種中藥潛在作用靶點再次合并去重,獲得腎炎防衰液潛在作用靶點共701個。將5種中藥的潛在作用靶點繪制韋恩圖,可見多種中藥具有共同靶點。(見圖1)
圖1 中藥潛在作用靶點分布
2.2 RIF靶點及共有靶點的獲取 應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取RIF靶點328個,通過DisGeNET平臺獲得138個,兩者合并去重后獲得RIF潛在靶點共429個,與腎炎防衰液的潛在作用靶點通過韋恩圖取交集,獲得76個共有靶點(見圖2),這些靶點可能是腎炎防衰液治療腎間質(zhì)纖維化的潛在作用靶點。將這些靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫,限定物種為“Homo sapiens”,導(dǎo)出數(shù)據(jù)后應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)共涉及76個節(jié)點和967條邊,節(jié)點表示成分與靶點,邊表示兩者之間相互作用,自由度是重要的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),表示與該節(jié)點直接相互作用的節(jié)點的數(shù)目,自由度越大,其關(guān)聯(lián)的生物功能越多,在網(wǎng)絡(luò)中的重要性就越大。結(jié)果顯示,共有37個靶點自由度值高于平均值(25.78),表明與其他蛋白相互作用較強(qiáng),可能具有重要作用。(見表1)
表1 自由度大于平均值的重要靶點
圖2 RIF與腎炎防衰液的潛在作用靶點分布
2.3 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將“2.2”項中獲取的76個共有靶點與其對應(yīng)的117個中藥成分通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò),篩選腎炎防衰液治療RIF相關(guān)的活性成分。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析,“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)共涉及194個節(jié)點,488條邊,節(jié)點的最大自由度為75,大于平均自由度(5.03)的活性成分有24個。(見表2)。
表2 可能參與腎炎防衰液治療RIF的活性成分
2.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將中藥、包含共有靶點的成分、共有靶點與RIF通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),紅色六邊形節(jié)點代表疾病,綠色菱形節(jié)點代表中藥,藍(lán)色矩形節(jié)點代表腎炎防衰液主要活性成分,黃色三角形節(jié)點代表潛在作用靶點。該網(wǎng)絡(luò)共有200個節(jié)點,682條邊,聚類系數(shù)0.357,網(wǎng)絡(luò)密度0.032,最短路徑為39 006(100%),網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性1.325,平均自由度為6.333。(見圖3)
圖3 腎炎防衰液治療RIF“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖
2.5 KEGG富集分析 將腎炎防衰液治療RIF的共有靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析,篩選校正P≤0.01的項目,共富集到99條信號通路,根據(jù)P值由小到大排列,發(fā)現(xiàn)腎炎防衰液可能通過以下途徑參與RIF的治療,如糖尿病并發(fā)癥的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、松弛素信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、白介素-17(IL-17)信號通路、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路、脂肪細(xì)胞脂肪分解的調(diào)節(jié)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路、Toll樣受體(TLRs)信號通路等。(見表3)
表3 腎炎防衰液治療RIF的潛在信號通路
2.6 分子對接 將24個核心成分作為小分子配體,選取自由度前5位的INS(PDB ID:6S4J)、IL-6(PDB ID:2HMH)、ALB(PDB ID:6RQ7)、VEGFA(PDB ID:4KZN)、TNF(PDB ID:2AZ5)作為蛋白受體進(jìn)行分子對接,并獲取其結(jié)合能。若結(jié)合能<0,表明兩者可自發(fā)結(jié)合,結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol為分子與靶點結(jié)合性較好[9],結(jié)合能越小表明結(jié)合活性越好。結(jié)果顯示,表中77.5%的活性成分可與靶點蛋白較好地結(jié)合。(見表4)將上述各基因與其結(jié)合排名前2位的化合物的分子對接模式可視化,可見上述化合物可很好地匹配INS、IL-6、ALB、VEGFA、TNF的活性口袋。(見圖4)
表4 腎炎防衰液核心成分與5種蛋白靶點的結(jié)合能(kJ/mol)
圖4 活性成分與靶點蛋白的結(jié)合模式
RIF的主要病理表現(xiàn)為間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖,ECM的過度沉積,細(xì)胞凋亡,腎小管損傷與大量炎癥細(xì)胞浸潤,其具體機(jī)制復(fù)雜,涉及多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)之間復(fù)雜的相互作用,單一途徑的藥物很難奏效。因此,中醫(yī)藥的多成分、多靶點、多途徑的特點具有一定優(yōu)勢。
腎炎防衰液是基于“腎絡(luò)癥瘕”理論而成,氣滯血行不暢、絡(luò)脈失養(yǎng)、氣血瘀滯、津凝痰結(jié)、絡(luò)毒蘊結(jié)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的血流動力學(xué)異常、細(xì)胞的保護(hù)及損傷、細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)至ECM等有形之質(zhì)的形成過程有一定相似之處[3-4]。在中醫(yī)方面消癥散結(jié),改善氣血、痰濁、絡(luò)毒等淤積,在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方面改善大量炎癥細(xì)胞浸潤、抑制ECM的過度沉積等是本方的初衷。目前,前期臨床及動物實驗已證實其對RIF具有治療作用,但具體機(jī)制尚未完全清楚,因此,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索其藥效學(xué)基礎(chǔ)及潛在作用機(jī)制以指導(dǎo)進(jìn)一步的研究。
經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩選,本研究共發(fā)現(xiàn)76個腎炎防衰液治療RIF的潛在作用靶點,包括INS、IL-6、ALB、VEGFA、TNF、MAPK1、IL-1β、EGF、EGFR、TP53、MAPK8、NOS3、MMP9、CCL2、PTGS2、MAPK14、MMP2等。包含這些靶點的活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、7-O-甲基異丙醇胺、豆甾醇、3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、蘆薈大黃素、芒柄花黃素、異鼠李亭、苯丁烯酮等。藥理學(xué)研究表明,槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、異鼠李素、蘆薈大黃素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮均具有一定的抗炎、抗腫瘤作用。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是迄今研究最多、最重要的致纖維化細(xì)胞因子,槲皮素可通過抑制TGF-β來延緩腎纖維化[10]。異鼠李素是源自槲皮素的代謝物,可調(diào)節(jié)NF-κB、PI3K/Akt、MAPK及其下游因子,阻斷TLR4途徑,減少ROS的產(chǎn)生以減輕炎癥反應(yīng),還可抑制ROS介導(dǎo)的HIF-1α積累來發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[11-12]。山萘酚可通過激活BMP-7-Smad1/5信號通路改善腎纖維化[13]。大黃酸是大黃中最具生物活性的成分,可通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR途徑來抑制UUO大鼠腎小管細(xì)胞的自噬,抑制UUO誘導(dǎo)的p-STAT3、膠原蛋白I和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)[14-15]。此外,β-谷甾醇、豆甾醇還具有明顯的降脂作用[16-17],芒柄花黃素有抗氧化、降低高血糖、胰島素抵抗等作用[18]。這些成分是腎炎防衰液發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ),提示腎炎防衰液可能通過抗炎、調(diào)節(jié)自噬、糖脂代謝等發(fā)揮治療作用。
本研究進(jìn)一步將76個腎炎防衰液治療RIF的潛在作用靶點進(jìn)行KEGG富集,發(fā)現(xiàn)腎炎防衰液可能通過抑制炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)糖脂代謝、自噬、ECM的沉積等多個方面延緩RIF進(jìn)程,與上文中活性成分的作用相符。
炎癥反應(yīng)在RIF的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。多種趨化因子、白細(xì)胞介素家族、黏附分子等可以刺激一系列炎癥信號傳導(dǎo)途徑,導(dǎo)致ECM過度沉積,腎間質(zhì)纖維化,最終導(dǎo)致腎功能不全。經(jīng)KEGG富集的通路中,TNF信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號通路、Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路等均與炎性損傷密切相關(guān)。JAK/STAT信號通路是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的重要通路?;罨蟮哪I間質(zhì)巨噬細(xì)胞可釋放大量的炎癥因子,進(jìn)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的激活,誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的分化與凋亡。此外,巨噬細(xì)胞的浸潤還可增加膠原的沉積,進(jìn)一步加速RIF的進(jìn)程。在本研究發(fā)現(xiàn)的潛在作用靶點中,多種細(xì)胞因子與JAK/STAT通路的激活相關(guān),如IL-2與STAT1、STAT3、STAT5A和STAT5B的激活密切相關(guān),IL-6可激活STAT1和STAT3,EGF可激活STAT3,IL-13可激活STAT6等。STAT1可與Runx調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合,作用于Smad3,STAT3與NF-κB的p50和p65亞基可直接結(jié)合,STAT1也與NF-κB存在協(xié)同作用[19-20]。可見JAK/STAT通路與本研究富集出的多個通路存在相互作用。TNF-α是TNF信號通路、MAPK信號通路和T細(xì)胞受體信號通路的關(guān)鍵因子,其作為最重要的炎癥因子之一參與了RIF進(jìn)程。激活的單核-巨噬細(xì)胞、損傷的腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等均可產(chǎn)生該因子,其具有加速ECM堆積、損傷腎單位、促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖、加速脂質(zhì)代謝等的作用,可進(jìn)一步加重RIF。同時,TNF-α與NF-κB也存在協(xié)同作用,其升高可促進(jìn)NF-κB水平的升高和NF-κB信號通路的激活,從而進(jìn)一步增加炎癥因子的表達(dá),導(dǎo)致炎癥損傷的加重。此外,Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)與絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)均參與介導(dǎo)腎纖維化中的促炎和促纖維化途徑[21]。松弛素可在UUO的早期階段下調(diào)TLR4-NF-κB信號通路,使巨噬細(xì)胞極化向M2表型轉(zhuǎn)移,并改善RIF[22]。
自噬在RIF初期具有保護(hù)腎臟的作用,但自噬的持續(xù)激活可促進(jìn)纖維化的產(chǎn)生[23]。PI3K/Akt信號通路具有調(diào)控自噬的作用,與RIF炎性損傷的發(fā)生有關(guān),其主要被TGF-β1激活,且參與其誘導(dǎo)的腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程[24],還可通過mTOR信號通路的激活抑制細(xì)胞自噬[25]。
此外,MMPs/組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMP)的失衡直接影響ECM的沉積,在RIF的機(jī)制中具有重要的位置。本研究發(fā)現(xiàn)的潛在作用靶點中,MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、PLG,COL1A1是MMPs活化和膠原降解中的重要因子,可調(diào)控ECM的沉積,與腎炎防衰液擬通過消癥散結(jié)法改善腎纖維化的初衷相通。
綜上所述,本研究篩選出腎炎防衰液多種可改善RIF的活性成分,發(fā)現(xiàn)其可能參與治療RIF的多種途徑,其中與炎癥反應(yīng)相關(guān)最多。全方可能通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控自噬、調(diào)節(jié)糖脂代謝等延緩RIF的發(fā)展。提示腎炎防衰液在抑制炎癥反應(yīng)方面的研究前景廣闊,對自噬反應(yīng)的調(diào)控也尚待進(jìn)一步的研究。