李 柯，戚建中，符國成，陳海剛，楊一棟，陳 丹

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013；2.華潤三九（郴州）制藥有限公司，湖南 郴州 423000；3.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102）

復(fù)方板藍根顆粒是由板藍根和大青葉兩種中藥材組成的中藥成方制劑，功能為清熱解毒，涼血。臨床用于溫病發(fā)熱、出斑、風(fēng)熱感冒、咽喉腫爛、流行性乙型腦炎、肝炎、腮腺炎等。

本品質(zhì)量標準收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》（中藥成方制劑第十二冊，WS3-B-2377-97）[1]，由于歷史的原因，制藥工藝粗放，質(zhì)控技術(shù)落后，過程風(fēng)險控制薄弱，這些因素制約了本品發(fā)展。經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查證，全國共有150家生產(chǎn)企業(yè)有本品批準文號，真正銷售過億元的廠家不多，各企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量差別較大[2-3]。基于臨床需要“好藥”，產(chǎn)業(yè)需要“大藥”的理念，促進其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，筆者前期進行了制備工藝研究，變更了藥品處方中已有藥用要求的輔料；改變影響藥品質(zhì)量的生產(chǎn)工藝[4]。在工藝變更的基礎(chǔ)上，本研究以小試、中試及工藝驗證21批產(chǎn)品為樣本，以精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸和靛玉紅為指標性成分，建立薄層色譜鑒別方法；以尿苷、鳥苷和腺苷為指標性成分，建立高效液相色譜含量測定方法并確定了三者總含量的限度。經(jīng)方法學(xué)驗證，所建立的質(zhì)量標準可以控制本品的質(zhì)量。

1 材 料

1.1 儀器Waters e2695高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；XS204電子分析天平[瑞士梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥復(fù)方板藍根顆粒[批號：1804001N，1804002N，1804003N，華潤三九（郴州）制藥有限公司]，大青葉（批號：190301，產(chǎn)地：甘肅）購自郴州凱程醫(yī)藥有限公司，板藍根（批號：20190201，產(chǎn)地：黑龍江）購自安徽省亳州市醫(yī)藥供銷有限公司，兩味藥材經(jīng)檢驗均符合2015年版《中華人民共和國藥典》第一部藥材標準。鳥苷對照品（批號：111977-201501，含量93.6%），尿苷對照品（批號：110887-201803，含量99.5%），腺苷對照品（批號：110879-200202，含量100%），R,S-告依春對照品（批號：111753-201706，含量100%），以上對照品均購自中國食品藥品檢驗研究院；甲醇[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，色譜級]；其他試劑均為分析級。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1氨基酸的薄層鑒別 取本品2 g，加乙醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。取板藍根對照藥材0.5 g，加乙醇20 mL，同法制成對照藥材溶液。另取L-脯氨酸、精氨酸、亮氨酸對照品，分別加乙醇制成每1 mL含1 mg溶液，作為對照品溶液。另外，根據(jù)處方比例分別稱取缺板藍根、缺大青葉藥材制成缺板藍根、缺大青葉的陰性溶液。照薄層色譜法《中華人民共和國藥典》2020年版四部（通則0502）試驗，吸取對照藥材溶液1 μL，對照品溶液1 μL，供試品溶液與陰性溶液2～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（19∶5∶5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品和缺大青葉陰性樣品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，缺板藍根陰性樣品無精氨酸對照品斑點，說明精氨酸屬于板藍根專屬性成分。（見圖1）

圖1 復(fù)方板藍根顆粒中氨基酸的薄層色譜圖

2.1.2 靛玉紅的薄層鑒別[5]取本品30 g，研細，加水50 mL溶解，再加50 mL三氯甲烷，加熱回流1 h后，取三氯甲烷層溶液，濃縮至1 mL作為供試品溶液。另取靛玉紅對照品，加三氯甲烷制成每1 mL含0.1 mg的溶液作為對照品溶液。按照薄層色譜法《中華人民共和國藥典》2020年版四部（通則0502）試驗，吸取對照藥材溶液5μL，對照品溶液5μL，供試品溶液10～15μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶1）為展開劑，展開取出，晾干，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。（見圖2）

圖2 復(fù)方板藍根顆粒中靛玉紅的薄層色譜圖

2.2 成分的含量測定[6-8]

2.2.1 色譜條件Kromasil 100-5-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇為流動相A，以水為流動相B，梯度洗脫（0～3 min，2%A；3～16 min，2%→5%A；16～20 min，5%→8%A；20～30 min，8%A；30～35 min，8%→20%A；35～42 min，20%→90%A；42～48 min，90%A；48～50 min，90%→2%A；50～60 min，2%A）；檢測波長為245 nm，流速為0.8 mL/min；柱溫為25℃，進樣體積5 μL，理論塔板數(shù)按尿苷峰計算應(yīng)不低于5 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別取尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春各20 μg及腺苷25 μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）10 min使溶解，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。2

.2.4陰性對照溶液 按復(fù)方板藍根顆粒處方和制備工藝制備缺板藍根的陰性樣品、缺大青葉的陰性樣品，并按“2.2.3”項下方法分別制成缺板藍根、缺大青葉的陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。（見圖3）

圖3 復(fù)方板藍根顆粒HPLC圖

2.3 線性關(guān)系考察取尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷對照品貯備液各1 mL，分別稀釋2、5、10、20、50倍，制備成一系列不同濃度的對照品溶液。進樣5 μL，測定，以濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行回歸分析，尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷的回歸方程分別為：Y=97.475-0.000、Y=162.308X-0.005、Y=505.581X-0.052、Y=138.411X-0.005。r值均為1.000，結(jié)果表明尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷的濃度分別0.004～0.209、0.002～0.102、0.0008～0.0420、0.001～0.061μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗取同一份均勻供試品溶液（批號：1804001N），按照測定法連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算各指標峰面積的相對標準偏差，結(jié)果尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷的RSD分別為0.3%、0.2%、0.9%、0.2%，表明本方法儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗精密稱取已研細的本品（批號：1804001N）1.5 g，按照供試品溶液的制備方法制備，取供試品溶液分別于0、6、16、24、32、38、46、56、64 h分別進樣5 μL，記錄色譜峰面積，計算相對標準偏差。結(jié)果尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷的RSD值分別為1.7%、1.1%、1.9%、2.1%，表明4個成分在64 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗取同批號已研細的本品（批號：1804001N）1.5 g，精密稱定，按照供試品溶液的制備方法制備樣品，一式6份，按色譜條件進行測定，進樣5 μL，記錄色譜圖，計算含量和相對標準偏差，結(jié)果尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷的含量 分 別 為0.26、0.14、0.06、0.08 mg/g，RSD值 分 別 為2.2%、0.6%、0.9%、2.3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗取已知含量的本品（批號：1804001N）0.75 g，一式6份，分別加入同一濃度（相當于100%濃度水平）的尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春及腺苷混合對照品溶液后，按照供試品溶液的制備方法制備，平行制備6份供試品。按照測定法測定，計算回收率（%）及其相對標準偏差（RSD）。結(jié)果見表1～4。

表1 尿苷準確度試驗測定結(jié)果

表2 鳥苷準確度試驗測定結(jié)果

表3 （R,S）-告依春準確度試驗測定結(jié)果

表4 腺苷準確度試驗測定結(jié)果

2.8 樣品含量測定及限度的確定

2.8.1 不同批次樣品含量測定及指標成分的選定 按擬定的方法，分別對21批次復(fù)方板藍根顆粒[999R華潤三九（郴州）制藥有限公司]進行含量測定，結(jié)果表明尿苷、鳥苷、腺苷穩(wěn)定，（R，S）-告依春穩(wěn)定性不好，不適宜作為含量測定指標。（見表5）

表5 21批次顆粒尿苷+鳥苷+腺苷總含量及（R,S）-告依春含量結(jié)果

2.8.2 不同廠家樣品含量測定及限度的確定 購買了市場上銷量較大的17個廠家共32批次的復(fù)方板藍根顆粒，以尿苷、鳥苷、腺苷總量為測定指標進行測定，結(jié)果表明各個廠家尿苷、鳥苷、腺苷總含量差異較大，含有量限度按照平均值（4.40 mg/袋）下浮30%計算，建議規(guī)定本品每袋含板藍根以尿苷、鳥苷、腺苷總量計不得少于3.0 mg。（見表6）

表6 不同廠家復(fù)方板藍根尿苷、鳥苷、腺苷總含量測定結(jié)果

續(xù)表6：

3 討 論

板藍根藥材含量控制成分為（R,S）-告依春，且屬于板藍根特征性成分，但文獻報道該成分極不穩(wěn)定，無論在藥材、各類制劑中含量穩(wěn)定性均極差[9-10]，這與工藝驗證3批復(fù)方板藍根顆粒穩(wěn)定性研究結(jié)果吻合，且按單位含量計（mg/g）在本品中含量低于萬分之二，不適合選擇將其作為含量質(zhì)控成分；另板藍根顆粒與復(fù)方板藍根顆粒處方組成類似，工藝均為水提醇沉，2019年8月國家藥典委員會最新公示的板藍根顆粒中已取消（R,S）-告依春的測定，鑒于此，暫不考慮將（R,S）-告依春作為本品含量測定的指標性成分，同時鑒于3個成分化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，均屬于核苷類成分，參照板藍根顆粒最新公示稿標準，以3個成分總量作為本品含量限度控制標準。

對市售32批復(fù)方板藍根顆粒中尿苷、鳥苷、腺苷的總量測定，結(jié)果表明差異較大[2-3,11]，建議生產(chǎn)企業(yè)建立從藥材、中間體和成品的質(zhì)量控制體系，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量。