梁積峰，溫 瑤，楊博宇，林 禮，范雄偉*，張 凱，李 芳*

(1.湖南師范大學心臟發(fā)育研究中心，省部共建淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室，動物多肽藥物創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程實驗室，中國 長沙 410081；2.中南大學湘雅醫(yī)院老年病科，國家老年疾病臨床研究中心，中國 長沙 410008)

目前全世界每年有180萬～800萬的人被確診為肺癌，其中死亡人數(shù)高達160萬～600萬。因環(huán)境、醫(yī)療等地區(qū)差異，肺癌的5年生存率約為4%～17%[1,2]。在中國，所有癌癥中肺癌的發(fā)病率和致死率均位于第一，肺癌死亡成為我國僅次于中風、缺血性心臟病的第三大致死性疾病。肺癌發(fā)病機制未知，大量研究表明長期吸煙、在污染的空氣中呼吸和遺傳易感性等誘因協(xié)同導致肺癌發(fā)生[3]。

由于不同類型肺癌亞群或克隆在腫瘤內的異質性，肺癌的治療面臨巨大挑戰(zhàn)。新誘導因子和抑制因子的鑒定以及對肺癌病因學的深入了解，是發(fā)展有效的肺癌治療方法的關鍵。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)信號途徑是生物體內重要的信號轉導途徑之一，參與細胞的基因表達調控和細胞質功能調控等過程[4,5]。通路中關鍵基因應激活化蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)[6]以及和JNK類似的應激活化蛋白基因P38等異常激活或抑制都會誘導細胞自噬或凋亡[7]，并與多種腫瘤的發(fā)生有關[8]。細胞凋亡是維持生物內環(huán)境穩(wěn)定的一種重要生理機制，涉及多基因的激活、表達及調控，而細胞凋亡的抑制以及自噬的失衡是腫瘤發(fā)生的重要的細胞學基礎。自噬是另一種啟動細胞程序性死亡的方式，與凋亡共同調控細胞生存和死亡[9]。抑癌基因p53的激活將導致細胞凋亡增加[10]。自噬相關蛋白beclin1和LC3A/B作為自噬特異性標記分子，介導細胞自噬進而影響凋亡[11]。

Popeye結構域(Popeye domain containing, POPDC)基因家族由POPDC1，POPDC2和POPDC3組成。POPDC基因家族編碼一類含有3個跨膜螺旋結構域和一個進化保守的細胞質popeye結構域的新型環(huán)磷酸腺苷 (Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)效應蛋白[12]。在小鼠和斑馬魚中進行的功能缺失實驗證實POPDC家族在骨骼肌再生、心律控制和應激信號傳導方面起重要作用[13]。最近幾年，POPDC家族在癌癥中的作用研究也取得了一定進展。乳腺癌中，POPDC1通過抑制表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制癌癥的發(fā)展[14]。在肺癌中，POPDC1的甲基化程度顯著增加[15]。在胃癌中，POPDC3的低表達預示著較低的生存率[16]。然而POPDC2是否參與了肺癌的發(fā)生，在臨床樣本中POPDC2是否存在差異性表達以及POPDC2在肺癌中的細胞學功能，尚不清楚。

本研究試圖分析POPDC2在肺癌組織中的表達情況，在A549細胞中過表達POPDC2，檢測其對細胞凋亡水平、相關凋亡基因和MAPK信號通路關鍵基因表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 A549(人類肺腺癌肺泡基底上皮細胞)細胞系，從湖南師范大學生命科學學院心臟發(fā)育研究中心獲得。

1.1.2 試劑和實驗材料 pCMV-Tag2B-POPDC2質粒從湖南師范大學生命科學學院心臟發(fā)育研究中心獲得；1640細胞培養(yǎng)基和FBS購自thermo fisher生物公司；RIPA蛋白裂解液，蛋白酶抑制劑，磷酸化酶抑制劑，蛋白印跡膜再生液/抗體剝離液以及5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自康為生物有限公司；POPDC2抗體，p53抗體、beclin-1抗體、LC3A/B抗體，P38抗體、p-P38抗體、JNK抗體、p-JNK抗體，β-actin抗體、GAPDH抗體、鼠二抗和兔二抗均購自abcam生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌患者的80%，最常見的類型為肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)和肺鱗狀細胞癌(Pulmonary squamous cell carcinoma，LUSC)。使用TCGA數(shù)據(jù)庫(鏈接http://gepia2.cancer-pku.cn/#analysis)實時分析LUAD和LUSC癌組織與正常組織的各基因表達情況。

1.2.2 A549細胞轉染 步驟如下：培養(yǎng)80%融合度的A549細胞；將10 μL過表達POPDC2質粒與100 μL轉染稀釋液混勻振蕩離心，靜置5 min；再與加入10 μL Lipo 2000的100 μL稀釋液混勻振蕩離心；靜置20 min，隨后將混合液加入A549細胞中。

1.2.3 流式細胞術檢測 步驟：1)收集細胞3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清；2)使用PBS漂洗2次，棄去上清；3)加入提前預冷好的PBS 1 mL，乙醇2.5 mL，4 ℃固定過夜；4)3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清；5)用PBS漂洗2次，棄去上清，隨后加入1 mL PBS，再加入終濃度為50 g·L-1的RNase A；6)每隔5 min搖晃一次，37 ℃消化30 min；7)放在冰盒上終止消化；8)過一次38 μm的尼龍篩放入流式上樣管中；9)加入50 μL含1% Triton的PI，室溫避光染色5 min。

1.2.4 細胞總蛋白提取 吸棄1640培養(yǎng)基后，用PBS漂洗3次；用細胞刮將細胞刮下，收集到一個1.5 mL的離心管中，加入適量裂解液，封上封口膜，用細胞超聲破碎儀破碎20次，每次5 s，間隔5 s，隨后冰上裂解15 min；再按照說明書加入終濃度為1×的SDS蛋白上樣緩沖液，用漩渦震蕩機混勻之后放入沸水浴10 min，然后12 000 r·min-1離心10 min取上清，分管凍存在-80 ℃。

1.2.5 免疫印跡(Western Blot)分析 先根據(jù)目的蛋白目的條帶選擇合適的蛋白膠濃度，再根據(jù)標準Marker條帶大小取所需要的蛋白條帶，轉移到NC 膜上牛奶封閉，孵育一抗；洗滌，孵育二抗；洗滌，滴加蛋白顯影液后于顯影儀上顯影。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)用T檢驗的方法進行顯著性分析統(tǒng)計差異，*P<0.05即具有統(tǒng)計學差異。利用Graphpadprism 7制圖。

2 結果

2.1 POPDC2在肺癌組織中的表達

使用GEPIA平臺對公共數(shù)據(jù)庫TCGA中LUAD和LUSC的mRNA表達水平進行分析。選取483例LUAD和486例LUSC癌組織，另取相應的癌旁正常組織作為對照，對POPDC2在不同組織中的表達水平進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，相比于對照，POPDC2在LUSC和LUAD中顯著下調(圖1)。

T：肺癌組織；N：癌旁正常組織；*P<0.05。

2.2 pCMV-tag2B-POPDC2質粒在A549細胞系中表達POPDC2蛋白

將pCMV-tag2B-POPDC2質粒轉染到A549中，表達48 h后提取總蛋白，使用POPDC2特異性抗體進行免疫印跡實驗。結果表明POPDC2蛋白表達水平顯著提高(圖2)。

圖2 POPDC2在A549中過表達

2.3 POPDC2影響細胞凋亡

在長滿的A549細胞中分別轉染空載質粒和pCMV-Tag2B-POPDC2過表達質粒48 h后，使用流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)轉染POPDC2過表達質粒的細胞，凋亡數(shù)目比例顯著增加(圖3)。

圖3 過表達POPDC2后細胞凋亡情況

2.4 POPDC2對凋亡相關基因的影響

p53,beclin和LC3A/B是細胞凋亡和自噬的重要標志性基因。對轉染了空載和pCMV-tag2B-POPDC2質粒的A549細胞提取總RNA，使用qPCR檢測其mRNA表達變化情況。結果表明，過表達POPDC2會顯著上調A549細胞中的p53，beclin和LC3A/B的轉錄水平(圖4)。

數(shù)據(jù)來自3組實驗重復，*P<0.05，****P<0.0001。

隨后提取總蛋白，通過WB檢測這3個基因的蛋白表達差異。結果表明，過表達POPDC2后，p53，beclin和LC3A/B的蛋白水平均顯著增加(圖5)。

2.5 POPDC2對MAPK信號通路相關基因的影響

MAPK信號通路異常與癌癥發(fā)生緊密相關，JNK和P38作為該通路中的分子標記，與細胞生長、凋亡都有關。對過表達POPDC2后的樣品檢測其JNK，P38以及相應的蛋白磷酸化水平。結果發(fā)現(xiàn)，JNK和P38蛋白表達較于對照沒有發(fā)生明顯變化，但是二者的磷酸化水平都發(fā)生了顯著上調(圖6)。

a：凋亡/自噬相關基因在過表達POPDC2后的蛋白差異表達;b：蛋白表達量化統(tǒng)計。數(shù)據(jù)來自3組實驗重復，*P<0.05。

a：MAPK通路相關基因在過表達POPDC2后的蛋白水平，b：磷酸化蛋白表達量統(tǒng)計。數(shù)據(jù)來自3組實驗重復，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

本研究使用TCGA數(shù)據(jù)庫首次分析了POPDC2在LUAD和LUSC中的表達情況。數(shù)據(jù)顯示，POPDC2在兩種肺癌亞型中都有所下調，提示POPDC2和肺癌之間具有一定的關聯(lián)。一項對49例非小細胞肺癌患者癌組織的POPDC1基因甲基化水平檢測研究中發(fā)現(xiàn)，相對于正常組織，癌組織甲基化頻率顯著增加[15]。POPDC3表達也是影響胃癌患者預后的獨立因素。有研究表明，在306例胃癌患者中，存在228例POPDC3低表達。使用Kaplan-Meier法進行生存分析顯示，低表達POPDC3的早期胃癌患者3年生存率降低51.9%，晚期胃癌患者為32.6%[16]。研究提示POPDC2可能與直腸癌發(fā)生存有相關，在耐藥結性直腸癌細胞系中，POPDC2表達水平較低[17]。這一結果與本研究的生物信息學分析相一致，說明POPDC2與肺癌的發(fā)生可能相關。

cAMP是一種普遍存在的第二信使，通過蛋白激酶A (protein kinase A system，PKA)的激活調節(jié)多種細胞生物學過程[18]，包括細胞周期阻滯、自噬、遷移、凋亡[19]。淋巴細胞中cAMP的長期升高可促進淋巴樣細胞的生長阻滯和凋亡，尤其是不成熟淋巴樣細胞。使用霍亂毒素在小鼠T淋巴瘤細胞增加cAMP水平能誘發(fā)細胞凋亡[20]。在As2O3誘導凋亡的人乳腺癌細胞中，POPDC2基因的表達顯著上調[21]，提示POPDC2可能參與癌癥化療誘發(fā)的細胞凋亡。筆者使用流式細胞術分析也證實，過表達POPDC2能促進A549細胞凋亡，與同行們在乳腺癌中的研究結果相一致，提示POPDC2可能通過促進細胞凋亡的作用，抑制肺癌的發(fā)生。

POPDC2對肺癌的促凋亡作用機制可能是通過JNK和P38實現(xiàn)的。有研究發(fā)現(xiàn)，JNK和P38的活化能誘發(fā)細胞凋亡。使用甘草查爾酮A處理人鼻咽癌細胞系NPC-BM后JNK和P38磷酸化水平顯著增加，通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)癌細胞活力顯著降低，同時伴隨著細胞凋亡顯著增加[22]。使用棕櫚酸酯處理人肝癌細胞系Huh-7后，死亡受體DR5mRNA水平顯著上調，JNK蛋白磷酸化水平顯著上升[23]。在人結腸癌細胞系HCT-116中失活P38會阻斷三?；视偷暮铣桑瑴p緩細胞凋亡過程中脂滴的聚集[24]，表明P38能介導結腸癌的細胞凋亡。筆者通過免疫印跡檢測同樣發(fā)現(xiàn)POPDC2過表達顯著增加了P38和JNK蛋白磷酸化水平。提示POPDC2過表達激活P38和JNK蛋白磷酸化，隨后誘導A549肺癌細胞凋亡。

p53也是細胞凋亡的重要調控因子。p53的調控與P38的活性有關，有學者使用依托泊苷誘導MCF-7細胞構建DNA損傷模型后，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡的同時，p53蛋白水平顯著上調并伴隨著P38的磷酸化水平顯著增加[25]。本研究也顯示，過表達POPDC2的肺癌細胞中p53表達上調，但其調控的具體分子機制尚不明確。此外，beclin1和LC3A/B可以通過調節(jié)細胞自噬影響細胞凋亡。JNK的活化參與細胞自噬的調控。研究發(fā)現(xiàn)，在人肝癌細胞HCC中過表達骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP4后，beclin1和LC3蛋白水平上調，且伴隨著JNK的磷酸化激活，隨后使用JNK高選擇性抑制劑SP600125處理發(fā)現(xiàn)beclin1和LC3的表達顯著降低[26]。在過表達POPDC2的肺癌細胞中，beclin1和LC3A/B蛋白水平顯著上調，這有可能是JNK信號被活化的緣故。但是，JNK相關的自噬在POPDC2促凋亡過程中發(fā)揮多大作用及其作用機制尚不清楚,值得進一步研究。

綜上所述，本研究證實POPDC2促進肺癌細胞凋亡。在肺癌的病理發(fā)生中，POPDC2的表達下調有可能喪失其對肺癌細胞的促進作用從而調控肺癌的發(fā)生，本研究為臨床診斷和干預肺癌的發(fā)生提供了新的分子靶標。