徐 永，寧國龍，胡宗舉，湯 磊

0 引 言

原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)指起源于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，其中肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占90%以上[1]。對于無法接受根治手術(shù)的HCC患者，臨床常采用肝動脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)治療[1]；但TACE術(shù)后易出現(xiàn)疾病進(jìn)展，嚴(yán)重影響患者治療效果及生存狀況。如何早期預(yù)測并指導(dǎo)臨床干預(yù)是關(guān)鍵[2]。HBV感染可引起反復(fù)肝細(xì)胞損傷，是當(dāng)前公認(rèn)與肝癌發(fā)病關(guān)聯(lián)密切的因素；且有研究認(rèn)為，積極抗HBV治療可降低TACE術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險[3]。實際中HBV感染并不能解釋全部的肝癌發(fā)病或TACE術(shù)后疾病進(jìn)展，尋找與肝癌生物學(xué)特征關(guān)聯(lián)密切的敏感生物標(biāo)志物以評估患者預(yù)后是當(dāng)前研究熱點之一[4]。高爾基體蛋白73(Golgi protein 73，GP73)是主要表達(dá)于結(jié)腸、前列腺等組織上皮細(xì)胞的一種新的高爾基膜蛋白。其在正常肝細(xì)胞中呈低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)，但當(dāng)包括病毒感染在內(nèi)的多種原因所致肝損傷時，GP73可在肝組織中大量表達(dá)并釋放入血[5]。白細(xì)胞介素-18(IL-18)是一種主要由免疫細(xì)胞分泌的前炎性因子，具有廣泛生物學(xué)功能。近年來有研究認(rèn)為，IL-18可參與很多疾病免疫性病理損害過程，且在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展占重要地位[6]。本研究以HCC患者為研究對象，通過檢測血清GP73、IL-18表達(dá)，并分析兩者與患者HBV感染及TACE術(shù)后疾病進(jìn)展關(guān)系，旨在為臨床HCC預(yù)后評估及干預(yù)提供支持。

1 資料與方法

1.1 研究對象回顧性分析2016年1月-2019年7月于本院確診并接受治療的107例HCC患者臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》中HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；均接受TACE治療；入院前未接受抗HBV治療、放化療、靶向治療、手術(shù)治療；年齡>18歲；肝功能Child-Pugh分級A～B級；精神、認(rèn)知良好；取得隨訪配合。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝癌復(fù)發(fā)患者；合并肝膿腫血管瘤、肝性腦??；存在其他部位惡性腫瘤；合并重要器官功能不全、凝血功能障礙、免疫系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾??；預(yù)期生存時間<3個月；治療依從性差；無法獲得隨訪配合。107例患者中，男71例，女36例，年齡28～73歲，平均(49.59±9.08)歲。參照HBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》將納入研究患者分為感染組65例、非感染組42例[8]。

1.2研究方法

1.2.1 血清指標(biāo)檢測采集患者入院后第2天清晨空腹肘靜脈血5 mL，以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心5min，留取上清液于EP管，-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?；選擇BIO-RAD公司伯樂-550型全自動酶標(biāo)儀，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、GP73、IL-18水平，試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，檢測步驟嚴(yán)格按試劑盒操作。

1.2.2HBV-DNA載量檢測采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，分離血清后分裝于EP管，于-4 ℃下保存?zhèn)溆?，?周內(nèi)完成HBV-DNA載量檢測；先采用磁珠吸附法提取血清HBV-DNA，DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；選擇HBV基因組相對保守區(qū)為靶目標(biāo)，設(shè)計特異性引物(引物序列5′-ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT-3′、5′-ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA-3′)及熒光探針(序列為5′-TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG-3′)；以實時熒光定量PCR法(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)法檢測HBV-DNA滴度，采用美國ABI公司7000型DNA擴(kuò)增儀，HBV核酸定量檢測試劑盒購自艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：37 ℃ UNG酶反應(yīng)3 min，93 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，55 ℃退火1 min，共35個循環(huán)，35 ℃冷卻10 s。DNA擴(kuò)增儀收集反應(yīng)信息，計算機(jī)自動計算定量結(jié)果，讀取待測樣本HBV-DNA拷貝數(shù)，HBV-DNA>1.0×103copies/mL為陽性。

1.2.3隨訪TACE術(shù)后結(jié)合患者情況，每1～2個月復(fù)查CT或MRI，參照實體瘤療效標(biāo)準(zhǔn)[9]。了解患者疾病進(jìn)展情況，其中基線病灶長徑總和增加20%，或見1個或多個新病灶視為疾病進(jìn)展；每3個月進(jìn)行1次門診隨訪，統(tǒng)計患者2年內(nèi)無進(jìn)展生存情況。

1.3觀察指標(biāo)比較感染組與非感染組血清AFP、GP73、IL-18水平，并進(jìn)一步根據(jù)患者血清GP73、IL-18水平將患者分為GP73高表達(dá)組、GP73低表達(dá)組以及IL-18高表達(dá)組、IL-18低表達(dá)組；分析感染組患者血清AFP、GP73、IL-18水平與HBV-DNA載量關(guān)系；隨訪2年，統(tǒng)計患者TACE術(shù)后無進(jìn)展生存情況，并分析其影響因素。

2 結(jié) 果

2.1 感染組與非感染組一般資料比較感染組與非感染組患者性別、年齡、體重指數(shù)、腫瘤直徑、分化程度、Child-Pugh分級比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表 1 感染組與非感染組一般資料比較

2.2感染組與非感染組血清AFP、GP73、IL-18水平比較感染組患者血清GP73、IL-18水平均顯著高于非感染組(P<0.05)；但兩組患者血清AFP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表 2 感染組與非感染組血清AFP、GP73、IL-18水平比較

2.3感染組患者血清AFP、GP73、IL-18水平與HBV-DNA載量相關(guān)性感染組患者血清GP73、IL-18均與HBV-DNA載量呈正相關(guān)(r=0.665、r=0.548，P<0.05)，且GP73與IL-18呈正相關(guān)(r=0.314，P<0.05)；AFP與血清GP73、IL-18及HBV-DNA載量之間均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

2.4患者TACE術(shù)后2年內(nèi)疾病進(jìn)展情況及Cox回歸分析結(jié)果107例患者均獲得隨訪資料，隨訪時間4～24個月，共84例患者發(fā)生疾病進(jìn)展，無進(jìn)展生存率21.50%(23/107)，中位無進(jìn)展生存期10個月。COX回歸分析顯示，HBV感染、分化程度、GP73、IL-18是影響患者TACE術(shù)后無進(jìn)展生存期的危險因素(P<0.05)。見表3。

表 3 影響患者TACE術(shù)后無進(jìn)展生存期的COX回歸分析

2.5血清GP73、IL-18水平對TACE術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測價值非HBV感染組TACE術(shù)后2年無進(jìn)展生存率高于感染組(Log Rankχ2=26.106，P<0.001)；GP73低表達(dá)組高于高表達(dá)組(Log Rankχ2=24.584，P<0.001)，IL-18低表達(dá)組高于高表達(dá)組(Log Rankχ2=41.309，P<0.001)。見圖1-圖3。

圖 1 HBV感染與否患者TACE術(shù)后無進(jìn)展生存函數(shù)

圖 2 血清GP73不同表達(dá)水平患者TACE術(shù)后無進(jìn)展生存函數(shù)

圖 3 血清IL-18不同表達(dá)水平患者TACE術(shù)后無進(jìn)展生存函數(shù)

3 討 論

據(jù)文獻(xiàn)顯示，全球范圍內(nèi)每年肝癌發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，死亡率居第3位，其中我國每年肝癌發(fā)病例數(shù)占全球總數(shù)50%以上，且近年來仍有上升趨勢[10]。HCC具有惡性程度高、預(yù)后差特點，外科手術(shù)、肝移植是當(dāng)前治愈HCC的唯一可能方案，但由于HCC早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術(shù)根治時機(jī)，TACE已成為延長HCC患者生存期的重要治療方法[11]。但TACE術(shù)后患者仍面臨著疾病進(jìn)展困擾，如何早期預(yù)測疾病進(jìn)展并針對性干預(yù)是關(guān)鍵[12]。

3.1HBV感染影響TACE術(shù)后疾病進(jìn)展HBV作為引起傳染性肝病常見病毒，已被研究證實與肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)聯(lián)密切，有文獻(xiàn)顯示，52%左右肝癌與HBV感染有關(guān)[13]。目前關(guān)于HBV感染與肝癌關(guān)聯(lián)機(jī)制有一定研究，但仍有許多不清晰地方，一般認(rèn)為可能涉及以下幾點[14]。①HBV感染后，病毒DNA可整合到肝細(xì)胞DNA，使得肝細(xì)胞DNA受損及功能障礙，造成肝細(xì)胞染色體不穩(wěn)定，誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌變；②HBV感染可能引起基因插入突變，激活原癌基因，使得肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化；③HBV感染通過表達(dá)多種病毒蛋白如HBx蛋白調(diào)控癌基因，影響肝細(xì)胞增殖活性，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌進(jìn)展。本研究中107例HCC患者，其中65例(60.75%)合并HBV感染，且HBV感染是患者TACE術(shù)后無進(jìn)展生存期的影響因素，提示在HCC患者診療過程中，應(yīng)重視HBV檢測及治療。

3.2血清GP73、IL-18水平與HBV感染呈正相關(guān)GP73蛋白是相對分子量為73 000Da的高爾基體Ⅱ型跨膜蛋白，其表達(dá)與高爾基體結(jié)構(gòu)完整性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，GP73主要表達(dá)于肝膽管上皮細(xì)胞；而在正常肝細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。當(dāng)各種原因引起肝細(xì)胞損傷時，肝細(xì)胞高爾基體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，GP73分泌可明顯升高，因此GP73在各種肝炎、肝硬化及肝癌組織中表達(dá)明顯增加[15]。本文研究顯示，GP73在肝癌合并HBV感染患者血清表達(dá)水平較非HBV感染者進(jìn)一步升高，且與HBV-DNA載量呈正相關(guān)，提示HBV感染可能導(dǎo)致GP73分泌增加。既往研究指出，多種細(xì)胞因子如干擾素-γ、白介素-6等可引起肝細(xì)胞GP73表達(dá)上調(diào)，慢性HBV感染可能通過介導(dǎo)相關(guān)免疫炎性損傷，引起大量炎性細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)GP73表達(dá)[16]；血清GP73水平與HBV感染者肝炎癥損傷、肝纖維化進(jìn)程及肝功能均有相關(guān)性[17]；上述研究支持本研究結(jié)果。IL-18是主要由巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞分泌的Th1型細(xì)胞因子，可參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，研究指出，IL-18與包括肝炎在內(nèi)的多種疾病免疫性病理損害有關(guān)[18]。在機(jī)體腫瘤免疫環(huán)境中，IL-18可通過誘導(dǎo)T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等活化提高機(jī)體對腫瘤細(xì)胞殺傷活性，還可以通過抑制血管生成來控制腫瘤生長，IL-18表達(dá)上調(diào)能反映出機(jī)體對腫瘤增生的高免疫狀態(tài)，但其表達(dá)過高也可引起腫瘤免疫逃逸，因此對患者并無益處[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，合并HBV感染的患者血清IL-18表達(dá)進(jìn)一步升高，且與HBV-DNA載量呈正相關(guān)，提示HBV感染可能引起IL-18高表達(dá)。既往文獻(xiàn)指出，HBV感染可通過激活肝臟枯否細(xì)胞，使得IL-18表達(dá)增加，而且相關(guān)病毒蛋白HBx蛋白可上調(diào)IL-18基因表達(dá)，引起IL-18表達(dá)升高[20]；支持本研究結(jié)果。

3.3血清GP73、IL-18水平影響TACE術(shù)后疾病進(jìn)展TACE術(shù)是當(dāng)前治療HCC最主要的非根治性方案，其原理在于通過栓塞劑阻塞肝動脈，并注入高濃度化療藥物，從而導(dǎo)致腫瘤組織缺血、壞死，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死、抑制腫瘤生長目的，但患者TACE術(shù)后容易因復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響治療效果[21]。本研究顯示，107例患者隨訪2年內(nèi)，無進(jìn)展生存率僅21.50%，提示TACE術(shù)后無進(jìn)展生存情況較差。本研究經(jīng)COX回歸分析發(fā)現(xiàn)，低分化、合并HBV感染是TACE術(shù)后無進(jìn)展生存期的影響因素，可能因為低分化意味著患者惡性程度高，而合并HBV感染意味著患者存在反復(fù)肝損傷風(fēng)險，這與既往報道一致[22]。本研究還顯示，血清GP73、IL-18也是患者TACE術(shù)后無進(jìn)展生存的影響因素，且均表現(xiàn)為高表達(dá)組無進(jìn)展生存率較低表達(dá)組下降，但具體影響機(jī)制本研究并未探討。既往有研究指出，GP73可通過調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來促進(jìn)肝癌進(jìn)展[23]；而IL-18可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶來促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移、遷徙[24]；上述研究均提示GP73、IL-18高表達(dá)可能通過某些免疫炎癥信號通路來促進(jìn)肝癌進(jìn)展。

綜上所述，血清GP73、IL-18在HCC合并HBV感染患者中表達(dá)上調(diào)，并與HBV-DNA載量呈正相關(guān)，HBV感染、GP73高表達(dá)、IL-18高表達(dá)均是導(dǎo)致患者TACE術(shù)后無進(jìn)展生存率下降的因素，臨床應(yīng)重視相關(guān)檢測。