張玉達(dá)，彭 亮，趙靜靜

上海市松江區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海 201600

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，2018年肝癌的發(fā)病率在所有癌癥中排第6位，是全球第4大癌癥死亡原因，每年約有78.2萬人死于肝癌[1]。肝癌的臨床治療包括肝切除、肝移植、放化療等，治療效果差且易復(fù)發(fā)[2-3]，晚期肝癌患者5年生存率低于5%，預(yù)后極差。以中國為首的亞洲發(fā)展中國家是肝癌的高發(fā)地區(qū)[4]。肝癌嚴(yán)重威脅著人們的健康，明確其發(fā)病機(jī)制，有針對性地采取早期干預(yù)措施是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，肝癌誘騙受體3(DcR3)的表達(dá)量越高，其對腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制作用越顯著[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)DcR3可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲性，增強(qiáng)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6]。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，DcR3促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和遷移，抑制了細(xì)胞凋亡指標(biāo)半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)和Bcl-2相關(guān)X(Bax)蛋白的表達(dá)[5]。自噬在真核細(xì)胞中廣泛存在，是一種基本生命現(xiàn)象，微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B)和程序性死亡受體1(Beclin1)是自噬途徑的關(guān)鍵物質(zhì)[7]。LC3B以LC3BⅠ和LC3BⅡ兩種形式存在并參與自噬，LC3BⅠ在正常情況下定位于細(xì)胞質(zhì),當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時，LC3B的細(xì)胞質(zhì)形式LC3BⅠ通過與脂質(zhì)分子磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合轉(zhuǎn)化為LC3BⅡ，靶向定位于自噬體膜，介導(dǎo)自噬溶酶體的形成[8]。在細(xì)胞的生理過程中，自噬、凋亡、程序性壞死都是細(xì)胞的死亡形式，它們相互影響、相互調(diào)節(jié)，自噬可能在細(xì)胞死亡過程中扮演重要角色。本研究通過在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)DcR3來觀察其對自噬功能的影響，為肝癌的早期診斷和預(yù)后判斷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1一般材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2儀器與試劑 含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)液(DMEM)，胎牛血清，胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；DcR3過表達(dá)慢病毒載體和空載慢病毒均購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；DcR3抗體、Beclin1抗體(Abcam 公司，美國)； LC3B抗體(美國Cell signaing公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記親和純化山羊抗小鼠IgG二抗(美國sigma公司)；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒。RT-PCR引物序列合成(上海生工生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 肝癌細(xì)胞株HepG2以每孔3×105個分布于六孔板，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到70%時，分別感染DcR3過表達(dá)慢病毒載體和空載慢病毒。對照組為LV-NC組(感染空載慢病毒)，實驗組為LV-DcR3組(感染DcR3過表達(dá)慢病毒載體)。以病毒滴度最小致死量(MIO)50 IU/mL加入病毒上清液(參照預(yù)實驗結(jié)果)。72 h 后收集LV-NC組和LV-DcR3 組細(xì)胞，然后進(jìn)行相關(guān)實驗。

1.3.2免疫印跡試驗(Western blot) 用預(yù)冷卻的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗收集的細(xì)胞3次，然后用細(xì)胞裂解液(RIPA)裂解細(xì)胞，測定蛋白量，加入5×上樣緩沖液進(jìn)行混勻，在100 ℃變性10 min，取30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)膜，將硝酸纖維素膜置于含5%脫脂奶粉的緩沖液中封閉2 h，吸取干凈封閉液后加入一抗(均為1∶1 000)，4 ℃搖勻過夜。洗滌緩沖液(TBST)洗膜3遍，每次10 min，分別加入稀釋后的二抗IgG(1∶1 000)，室溫避光孵育2 h。孵育后TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色蛋白條帶，然后進(jìn)行凝膠成像分析，共進(jìn)行平行實驗3次。

1.3.3RT-PCR Trizol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA的1 μg mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性15 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。引物序列見表1?；贏BI7500平臺收集RT-PCR數(shù)據(jù)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為對照，采用2-ΔΔCt計算相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1DcR3蛋白表達(dá)情況 本研究選擇DcR3表達(dá)較低且實驗常用的肝癌細(xì)胞株HepG2作為研究對象。DcR3過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染72 h后，用Western Blot驗證轉(zhuǎn)染情況。結(jié)果顯示，在相同印跡上以肌動蛋白B(ACTB)信號標(biāo)準(zhǔn)化成像條帶為標(biāo)準(zhǔn)，測定免疫印跡條帶的灰度值，LV-DcR3組DcR3蛋白的表達(dá)水平(1.88±0.15)明顯高于LV-NC組(0.74±0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明DcR3慢病毒轉(zhuǎn)染效率達(dá)到實驗要求。見圖1。

圖1 不同病毒感染細(xì)胞組的蛋白表達(dá)水平

2.2過表達(dá)DcR3對肝癌細(xì)胞自噬相關(guān)基因mRNA的影響 肝癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin1的mRNA相對表達(dá)水平結(jié)果顯示，LV-DcR3組LC3B和Beclin1 mRNA相對表達(dá)水平與LV-NC組相比，明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為Beclin1；B為LC3B。

2.3從蛋白相對表達(dá)水平觀察過表達(dá)DcR3對肝癌細(xì)胞自噬功能的影響 Western Blot結(jié)果顯示，在相同印跡上以ACTB信號標(biāo)準(zhǔn)化成像條帶為標(biāo)準(zhǔn)，與LV-NC組比較，LV-DcR3組LC3BⅡ/LC3BⅠ比例(1.65±0.15)、Beclin1蛋白相對表達(dá)水平(0.89±0.05)顯著低于LV-NC組(LC3BⅡ/LC3BⅠ比例為3.48±0.31、Beclin1蛋白相對表達(dá)水平為1.41±0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 過表達(dá)DcR3的肝癌細(xì)胞自噬蛋白的相對表達(dá)水平

3 討 論

DcR3是腫瘤壞死因子受體超家族(TNFR)的成員之一，可與Fas配體(FasL)、腫瘤壞死因子配體相關(guān)分子1A(TLlA)競爭結(jié)合，從而阻斷以上配體誘導(dǎo)的凋亡[6]。有研究認(rèn)為肝癌組織中DcR3的表達(dá)水平高于癌旁組織及正常組織，且與腫瘤分化、漿膜浸潤、肝外轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。然而，DcR3在肝癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的確切機(jī)制仍不清楚。

近年來，自噬作為細(xì)胞死亡方式的一種，成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。已有研究報道，自噬在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展或抑制腫瘤轉(zhuǎn)化中發(fā)揮雙重作用，提示自噬缺陷誘發(fā)腫瘤是一種促癌機(jī)制[8]。有研究表明，自噬在肝臟疾病從慢性肝病發(fā)展為肝硬化，最終發(fā)展為肝癌的病理機(jī)制中起著重要的促死亡(促癌)作用[9]。Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)是自噬途徑的關(guān)鍵物質(zhì)[10]。筆者推測DcR3可能影響自噬的過程。本實驗通過在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)DcR3以驗證此推測。

LC3B被認(rèn)為是參與自噬的關(guān)鍵因素，是監(jiān)測自噬的特殊指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)DcR3時，LC3B蛋白和mRNA相對表達(dá)水平均降低。有研究表明,LC3B在腫瘤區(qū)較正常鄰近組織表達(dá)水平更低[11]，與本研究結(jié)果一致。此外，一篇Meta分析顯示，LC3B的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤數(shù)量、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肝硬化、TNM分期、甲胎蛋白、血管侵犯、組織學(xué)分級和肝功能無關(guān)(P>0.05)，而與總生存期有關(guān)(P<0.05)[12]。

Beclin1是首個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物自噬蛋白，在自噬活性中起著重要的調(diào)節(jié)作用，在小鼠肝癌模型中發(fā)現(xiàn)Beclin1發(fā)揮抑癌作用[13]。肝癌組織中Beclin1表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，Beclin1表達(dá)水平與復(fù)發(fā)及生存率相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，DcR3過表達(dá)會抑制Beclin-1的表達(dá)。因此，這些結(jié)果表明，DcR3抑制了肝癌細(xì)胞中Beclin1和LC3B的表達(dá)，提示自噬可能受到DcR3的調(diào)控。

綜上所述，本研究通過體外實驗初步驗證了DcR3可以抑制自噬的發(fā)生，但由于是初步研究結(jié)果，LC3B和Beclin-1是否受DcR3調(diào)控，有待進(jìn)一步研究證實。