任翊卓 韓學凱 左佳俊 歐陽雪梅 段 虎 隋麗英

Piwi基因參與兩性鹵蟲(Artemia franciscana)的生殖調(diào)控研究*

任翊卓 韓學凱①左佳俊 歐陽雪梅 段 虎 隋麗英①

(亞洲區(qū)域鹵蟲參考中心 天津科技大學海洋與環(huán)境學院 天津 300457)

(P-element induced wimpy testis)基因編碼Piwi蛋白, 在生殖干細胞的自我更新、減數(shù)分裂過程、RNA沉默和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。為探究基因參與兩性鹵蟲生殖發(fā)育的作用, 從兩性鹵蟲轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得基因開放閱讀框, 進行序列分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測等生物信息學分析, 采用qPCR技術(shù)研究該基因在生殖腺發(fā)育不同時期表達特征, 并利用RNAi顯微注射技術(shù)探究其功能。生物信息學分析表明,基因的開放閱讀框長2 619 bp, 編碼872個氨基酸;基因編碼的蛋白分子量為98.11 kDa, 等電點為9.50, 為堿性親水性蛋白, 無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu); 存在Piwi和PAZ結(jié)構(gòu)域及ArgoL1結(jié)構(gòu)域, 二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主, 三級結(jié)構(gòu)與之對應(yīng); 系統(tǒng)進化樹顯示與蚤狀溞和大型溞的序列相似性最高。qPCR結(jié)果表明,基因在卵巢的卵黃發(fā)生晚期和晚期胚胎表達量最高, 顯著高于卵黃發(fā)生早期和早期胚胎(<0.01);基因在精巢的未成熟期表達量最高, 顯著高于成熟早期、成熟中期和成熟晚期(<0.01)。RNAi結(jié)果顯示, 該方法能顯著降低基因的表達水平(<0.01), 并導致所產(chǎn)后代均為休眠卵, 說明基因不但在生殖發(fā)育調(diào)控起重要作用, 而且可能在其繁殖方式?jīng)Q定過程中起關(guān)鍵作用。研究結(jié)果為兩性鹵蟲Piwi/piRNA功能和分子機制調(diào)控的研究提供了基礎(chǔ)信息, 將有助于揭示基因參與調(diào)控兩性鹵蟲生殖發(fā)育機制。

;基因; 生殖腺; 基因表達特征; RNAi

Piwi (P-element induced wimpy testis)蛋白屬于Argonaute蛋白家族, 是RNA沉默通路中的主要蛋白。Argonaute蛋白具有PAZ和Piwi兩個主要結(jié)構(gòu)域(H?ck, 2008), 通過小RNAs介導基因調(diào)控從而在不同生理過程中促進細胞穩(wěn)態(tài)(Sheu-Gruttadauria, 2017)。基因在果蠅()生殖腺中被首次發(fā)現(xiàn), 在生殖干細胞的自我更新中發(fā)揮著重要作用(Cox, 1998), 主要由Piwi蛋白與小RNA (piRNAs)相互關(guān)聯(lián)形成復合體來實現(xiàn)其功能(Ozata, 2019)。研究發(fā)現(xiàn)Piwi蛋白在果蠅(Marie, 2017)、斑馬魚() (Houwing, 2007)和小鼠() (Xu, 2008)生殖系轉(zhuǎn)座子沉默中起關(guān)鍵作用, 是多種生物生殖系發(fā)育和干細胞自我更新過程的關(guān)鍵調(diào)控因子(Ramat, 2021)。 Piwi蛋白與piRNAs形成piRNA通路, 在生殖細胞發(fā)育、性別決定、劑量補償?shù)扰c有性生殖相關(guān)的發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用(Ramat, 2021)。或同源物基因的缺失會導致線蟲() (Wang, 2008)、蠅類(Li, 2009)及哺乳動物(Kim, 2012)的生育能力嚴重受損。在甲殼動物中研究發(fā)現(xiàn)Piwi蛋白可在斑節(jié)對蝦()生殖細胞發(fā)育中發(fā)揮作用,可能參與了精子成熟的后期階段(Sukthaworn, 2020)。此外, Piwi蛋白對piRNAs的生物合成(Czech, 2016)、表觀遺傳調(diào)控(Huang, 2013)以及癌細胞生存和轉(zhuǎn)移(Halajzadeh, 2020)都是至關(guān)重要的。

鹵蟲()屬小型甲殼動物, 廣泛分布于世界各地沿海鹽場和內(nèi)陸鹽湖高鹽水體中, 是鹵水生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的重要組成部分和生物調(diào)節(jié)者(Dattilo, 2005), 無節(jié)幼體是水產(chǎn)養(yǎng)殖育苗中重要的生物餌料(Lopes-dos-Santos, 2019)。鹵蟲具有世代周期短、子代產(chǎn)量高和易于培養(yǎng)等優(yōu)點, 是基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學研究的良好實驗動物(Manfra, 2015)。按照生殖方式, 鹵蟲可以分為兩性(Bisexual)鹵蟲和孤雌(Parthenogenetic)鹵蟲兩種類型, 并且均具有卵生(Oviparity)和卵胎生(Ovoviviparity)兩種繁育方式, 而鹵蟲生殖和繁育方式的特殊性也逐漸成為研究者關(guān)注的熱點。在鹵蟲生殖及性別決定方面, 鱗翅類性別決定基因的同源基因已被證實是調(diào)控鹵蟲性別分化的途徑之一(Li, 2017); p90 RSK被證實參與鹵蟲卵母細胞成熟及休眠胚胎細胞周期等過程(段如冰, 2014); 而小熱休克蛋白p26影響鹵蟲的胚胎發(fā)育并在休眠生殖途徑中發(fā)揮重要作用(King, 2012)?；蛟谏撤矫嫫鹬匾淖饔? Dung等(2019)在鹵蟲中發(fā)現(xiàn)了Piwi蛋白家族成員Ago, 但未對其功能進行研究, 而關(guān)于基因在鹵蟲中的研究尚未見報道。本研究以兩性鹵蟲為研究對象, 獲得該基因的ORF序列并對其進行生物信息學分析, 運用qPCR檢測生殖腺不同發(fā)育時期基因的表達特征, 利用RNAi技術(shù)探究其功能, 為揭示兩性鹵蟲的生殖發(fā)育調(diào)控機制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗選取兩性鹵蟲(VinhChau strain), 在28 °C光照條件下(24L : 0D)孵化培養(yǎng)。選取6個1L錐形瓶, 每個錐形瓶飼養(yǎng)200只兩性鹵蟲并投喂新鮮鹽生杜氏藻。根據(jù)孫瑜霞(2014)關(guān)于兩性鹵蟲胚胎發(fā)育的描述, 收集雌性鹵蟲卵黃發(fā)生早期(孵化后約16 d)、卵黃發(fā)生晚期(孵化后約19 d)、早期胚胎(孵化后約20 d)、晚期胚胎(孵化后約25 d)各個時期的卵巢。通過觀察雄性鹵蟲精巢的形態(tài)特征及成熟程度, 將雄蟲分為未成熟期(孵化后約8 d)、成熟早期(孵化后約13 d)、成熟中期(孵化后約19 d)、成熟晚期(孵化后約25 d)并收集各個時期的精巢, 將解剖后的組織迅速置于液氮中, 于–80 °C冰箱中保存。

1.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

取兩性鹵蟲卵巢和精巢組織, 采用Trizol法提取組織總RNA, 用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度, 并用核酸蛋白測定儀(Eppendorf BioPhotometer plus)測定RNA濃度, 后置于–80 °C冰箱保存。選用260/280范圍在1.8—2.0的RNA作為模板, 通過TaKaRa試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄, 將得到的cDNA分別作為常規(guī)PCR和qPCR模板, 并存于–20 °C冰箱備用。

1.3 兩性鹵蟲Piwi基因的獲得及分析

從前期構(gòu)建的兩性鹵蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得基因片段, 該基因序列包括完整的開放閱讀框(Open reading frame, ORF)。為保證基因序列的準確性, 利用Primer Premier5軟件設(shè)計3對基因特異性引物(表1), 拼接得到其完整ORF用于比對。本實驗涉及的引物均由北京華大基因科技有限公司合成。以兩性鹵蟲cDNA為模板進行擴增, PCR體系(25 μL): ddH2O 10.5 μL、Premix Ex Taq 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件: 94 °C預(yù)變性5 min; 94 °C變性1 min, 54 °C退火1 min, 72 °C延伸1 min 30 s, 35個循環(huán); 72 °C延伸10 min, PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶擴增結(jié)果, 將含有目的片段的PCR產(chǎn)物送到北京華大基因科技有限公司測序。

1.4 兩性鹵蟲Piwi基因的生物信息學分析

通過在線軟件(表2)對兩性鹵蟲基因進行生物信息學分析, 包括對測序拼接得到的序列進行ORF、理化性質(zhì)、親/疏水性、信號肽以及亞細胞定位預(yù)測分析, 并進行跨膜結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測; 采用NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫對兩性鹵蟲基因的氨基酸序列進行BLAST比對, 分析與其他物種的相似性; 利用MEGA5.0軟件將不同物種的氨基酸序列進行多重比對, 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 Piwi基因在兩性鹵蟲生殖腺不同發(fā)育時期的表達分析

根據(jù)測序得到的兩性鹵蟲基因序列設(shè)計qPCR特異性引物-F和R (表1), 以作為內(nèi)參基因?qū)尚喳u蟲卵巢和精巢不同發(fā)育時期的mRNA表達量進行qPCR檢測(美國伯樂Bio-rad)。反應(yīng)條件(20 μL): TB Green Premix Ex Taq II 10 μL、上下游引物各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL、cDNA模板2 μL。反應(yīng)程序為: 95 °C預(yù)變性3 min, 95 °C變性10 s, 退火60 °C 30 s, 40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個生物學重復和3個技術(shù)重復, 采用2–△△Ct法計算目的基因在生殖腺不同發(fā)育時期的相對表達量, 通過SPSS 25.0軟件對其進行單因素方差分析,<0.05為差異顯著,<0.01為差異極顯著。

表1 引物信息

Tab.1 The primer information

表2 生物信息學在線分析軟件

Tab.2 Online analysis software in bioinformatics

1.6 dsRNA的合成及顯微注射RNAi

利用Primer Premier5軟件設(shè)計并合成基因dsRNA引物ds-F和ds-R及陰性對照增強型綠色熒光蛋白基因dsRNA引物ds-F和ds-R (表1), 引物的5′端包含T7啟動子序列(TAATACGACTCACTATAGGG)。通過PCR擴增基因的ORF片段并進行純化回收, 獲得的基因片段連接到pGM-T載體上并提取質(zhì)粒, 使用TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit體外轉(zhuǎn)錄試劑盒從質(zhì)粒中體外轉(zhuǎn)錄dsRNA, 純化dsRNA并進行消化反應(yīng)檢測其質(zhì)量(王志偉, 2017)。陰性對照基因dsRNA的合成同上。

分別設(shè)置對照組(ds)和干擾組(ds), 每組60只雌性鹵蟲, 采用顯微注射(日本Nikon NARISHIGE)對活力較好并處于卵黃發(fā)生早期的雌性鹵蟲進行注射, 注射部位為雌性鹵蟲外骨骼和腸道之間的開放循環(huán)體腔。將dsRNA溶于磷酸緩沖液中并與0.1%酚紅混合(1︰1, 體積分數(shù))得到dsRNA顯微注射溶液, 每只雌性鹵蟲注射1 μL含1 000 ng dsRNA的溶液, 注射成功的雌性鹵蟲放入50 mL試管中單獨培養(yǎng)并進行雌雄配對。待雌性鹵蟲發(fā)育到卵黃發(fā)生晚期、早期胚胎和晚期胚胎時分別收集卵囊, 每個時期設(shè)置3個平行, 每個平行收集5個卵囊, 利用qPCR測定干擾效果。剩余的對照組和干擾組雌性鹵蟲各15只繼續(xù)培養(yǎng)并觀察產(chǎn)后代情況, 通過SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行卡方檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 兩性鹵蟲Piwi基因ORF序列的擴增及測序

經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳對基因的PCR產(chǎn)物進行檢測, 得到清晰單一的條帶(圖1), 對測序結(jié)果進行拼接比對后, 發(fā)現(xiàn)得到的基因序列與預(yù)期目的基因片段大小一致, 驗證后得到兩性鹵蟲基因ORF大小為2 619 bp, 編碼872個氨基酸。

圖1 兩性鹵蟲Piwi基因PCR擴增結(jié)果

注: M. Marker DL 2000; 1—3. 引物-F2/R2的擴增條帶; 4—6. 引物-F3/R3的擴增條帶; 7—9. 引物-F1/R1的擴增條帶

2.2 兩性鹵蟲Piwi基因的相似性分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

兩性鹵蟲基因氨基酸序列與昆蟲綱、甲殼綱(節(jié)肢動物門)和雙殼綱、瓣鰓綱(軟體動物門)相關(guān)物種的基因氨基酸序列相對較近, 相似性范圍為41.05%—43.02% (表3)。使用MEGA5.0軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進化樹(圖2), 表明兩性鹵蟲基因與蚤狀溞和大型溞的序列相似性最高。

2.3 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測分析

兩性鹵蟲基因編碼蛋白的分子式為C4362H6911N1237O1255S42, 分子質(zhì)量為98.11 kDa, 氨基酸總數(shù)為872, 含量最多的是甘氨酸Gly (8.1%)和纈氨酸Val(8.0%), 其次是精氨酸Arg (7.2%)和亮氨酸Leu (7.0%), 帶負電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為89, 帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為122, 總平均親水性(GRAVY)為–0.386, 理論等電點為9.50, 不穩(wěn)定指數(shù)為33.97。

2.4 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白的信號肽、親/疏水性及亞細胞定位預(yù)測分析

信號肽分析發(fā)現(xiàn)基因編碼蛋白無信號肽(圖3a)。親/疏水性分析得到748位點處的半胱氨酸(Cys)有最大值為2.222, 115位點處的天冬氨酸(Asp)有最小值為–2.844 (圖3b), 該蛋白為親水性蛋白。亞細胞定位發(fā)現(xiàn)該蛋白在細胞質(zhì)內(nèi)分布最多(47.8%), 其次為細胞核(30.4%), 線粒體(13%)、細胞骨架(4.3%)和質(zhì)膜(4.3%)分布最少。

表3基因氨基酸序列的相似性比較

Tab.3 Comparison in amino acid sequence similarity of Piwi gene

圖2 兩性鹵蟲Piwi基因氨基酸系統(tǒng)進化樹

圖3 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白信號肽、親水性、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

注: a. Piwi蛋白信號肽分析; b. Piwi蛋白親水性分析; c. Piwi蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測; d. Piwi蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

對Piwi蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含3個結(jié)構(gòu)域, 其中第241—291位氨基酸為ArgoL1結(jié)構(gòu)域, 第292—430位氨基酸為PAZ結(jié)構(gòu)域, 第418—855位氨基酸為Piwi結(jié)構(gòu)域(圖3c)。對跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)Piwi蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3d)。

2.6 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對Piwi蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白主要由4種折疊方式構(gòu)成, 282個α-螺旋占比32.34%, 177個延伸鏈占比20.30%, 39個β-轉(zhuǎn)角占比4.47%, 374個無規(guī)則卷占比42.87%(圖4a)。蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相符, 無規(guī)則卷、α-螺旋和延伸鏈是該蛋白結(jié)構(gòu)的主體(圖4b)。

圖4 兩性鹵蟲Piwi基因編碼蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

注: a. 兩性鹵蟲Piwi蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測; b. 兩性鹵蟲Piwi蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7 Piwi基因在兩性鹵蟲生殖腺不同發(fā)育時期的表達分析

通過qPCR檢測基因在兩性鹵蟲卵巢和精巢不同發(fā)育時期的表達量, 結(jié)果表明基因的表達普遍存在于卵巢和精巢中。在卵巢發(fā)育過程中,基因在卵黃發(fā)生晚期和晚期胚胎表達量最高, 顯著高于卵黃發(fā)生早期和早期胚胎(<0.01); 在精巢發(fā)育過程中,基因在精巢未成熟期表達量最高, 顯著高于精巢成熟早期、成熟中期和成熟晚期(<0.01) (圖5)。

圖5 Piwi基因在兩性鹵蟲不同發(fā)育時期卵巢和精巢中的表達

注: 相同字母表示差異不顯著(>0.05); 不同字母表示差異極顯著(<0.01)

2.8 RNAi干擾后Piwi基因的表達及對后代的影響

與對照組ds相比, 雌性鹵蟲在注射ds后的卵黃發(fā)生晚期、早期胚胎、晚期胚胎均檢測到基因的表達量極顯著降低(<0.01), 干擾效率分別為91%、82%、92%, 說明顯微注射實驗是成功的(圖6)。觀察RNAi干擾后雌性鹵蟲產(chǎn)后代的情況, 發(fā)現(xiàn)顯微注射后大約10 d對照組(ds)和干擾組(ds)均有后代產(chǎn)出。15只注射ds的雌性鹵蟲中有10只雌性鹵蟲存活并全部產(chǎn)休眠卵; 15只注射ds的雌性鹵蟲中有11只雌性鹵蟲存活, 其中9只產(chǎn)無節(jié)幼體, 2只產(chǎn)休眠卵, 卡方檢驗顯示對照組與干擾組產(chǎn)卵和產(chǎn)幼上存在極顯著差異(<0.01), 因此基因的敲降誘導兩性鹵蟲產(chǎn)休眠卵。

3 討論

本研究選取兩性鹵蟲為研究對象, 得到了基因完整的ORF為2 619 bp, 編碼872個氨基酸, 與甲殼動物中的中華絨螯蟹() (王敏, 2015)以及昆蟲中的家蠶() (廖珍, 2009)、小菜蛾() (Hameed, 2018)等物種的基因序列長度相似。生物信息學分析顯示, 兩性鹵蟲Piwi蛋白分子質(zhì)量為98.11 kDa, 總平均親水性(GRAVY)為–0.386, 推測該蛋白為親水性蛋白, 與親/疏水性預(yù)測結(jié)果一致; 正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)大于負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu), 故該蛋白帶正電荷; 理論等電點為9.50, 為偏堿性蛋白; 不穩(wěn)定指數(shù)為33.97, 屬于穩(wěn)定蛋白, 故該蛋白屬于穩(wěn)定的堿性親水性蛋白。兩性鹵蟲Piwi蛋白含有保守的PAZ和Piwi結(jié)構(gòu)域, 屬于Argonaute蛋白家族, 這與Dung等(2019)關(guān)于兩性鹵蟲ArAgo蛋白結(jié)構(gòu)域的研究結(jié)果一致。在動物中, Argonaute蛋白家族有AGO亞家族和PIWI亞家族兩個分支, 其中PIWI亞家族由N端結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域、MID結(jié)構(gòu)域和Piwi結(jié)構(gòu)域組成, 而PAZ結(jié)構(gòu)域和Piwi結(jié)構(gòu)域是最保守的(Sheu-Gruttadauria, 2017)。PAZ結(jié)構(gòu)域能夠與piRNA的3′結(jié)合, Piwi結(jié)構(gòu)域中心有引導單鏈裂解的RNaseH, 具有核酸內(nèi)切酶活性(Kwon, 2014)。

圖6 顯微注射后Piwi基因在兩性鹵蟲不同時期卵巢中的表達

注: **表示與對照有極顯著性差異(<0.01)

piRNAs是一類主要在動物生殖系中表達的非編碼小RNA, 與Piwi蛋白形成piRNA通路, 參與轉(zhuǎn)座子沉默和基因表達調(diào)控, 在生物發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Ramat, 2021)。該通路依賴piRNAs序列的特異性來識別轉(zhuǎn)座子靶點, 參與轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄后抑制和表觀遺傳來保護基因組的完整性; 通過Piwi蛋白提供效應(yīng)功能, 在動物生殖細胞防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用(Zhou, 2015)。Piwi蛋白是生殖腺發(fā)育過程中piRNA合成以及轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控所必需的, 該蛋白成員定位于不同的細胞區(qū)域(Tamtaji, 2020)。本研究通過生物信息學亞細胞定位預(yù)測, 發(fā)現(xiàn)Piwi蛋白主要分布在細胞質(zhì)(47.8%)和細胞核(30.4%)中, 推測Piwi蛋白在細胞核和細胞質(zhì)中發(fā)揮著重要作用。果蠅(Klattenhoff, 2008)和小鼠(Ishizu, 2012)的研究結(jié)論也證實了這一觀點, 果蠅的Argonaute蛋白家族成員Aubergine (Aub)蛋白和Argonaute 3 (Ago3)蛋白位于細胞質(zhì)和生殖細胞顆粒中, 它們在piRNA的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要作用, 而Piwi蛋白主要在生殖細胞核的轉(zhuǎn)錄沉默中起作用。此外, 小鼠中含有三種Piwi蛋白, Mili和Miwi在細胞質(zhì)內(nèi)參與piRNA合成, 調(diào)節(jié)細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄后沉默, 而Miwi2位于細胞核, 在調(diào)控細胞核沉默中發(fā)揮作用。本研究通過相似性比對可知,基因在昆蟲中的保守性較高, 且兩性鹵蟲與昆蟲的基因氨基酸序列相對較近。Li等(2017)的研究證實了鱗翅類性別決定基因Masc的同源基因是調(diào)控兩性鹵蟲性別分化的途徑之一, 也有報道稱家蠶卵巢培養(yǎng)細胞系BmN4特異性表達兩種PIWI亞家族蛋白Siwi和BmAgo3以及大量的piRNAs (Kawaoka, 2009), 此后又有研究發(fā)現(xiàn)家蠶中、基因可與Piwi蛋白組成“乒乓”性別級聯(lián)通路, 從而進一步完善了piRNA通路(Shoji, 2017), 這些結(jié)果表明兩性鹵蟲中基因可能與家蠶中基因行使著相似的功能。

為了進一步研究基因?qū)尚喳u蟲的調(diào)控功能, 本研究通過qPCR檢測基因在兩性鹵蟲生殖腺中不同發(fā)育時期的表達量, 結(jié)果顯示基因在兩性鹵蟲卵巢和精巢各個階段均有表達, 但表達量有顯著差異。在兩性鹵蟲受精前,基因在卵巢中的表達量逐漸上升, 到卵黃發(fā)生晚期基因表達量最高; 卵巢受精后,基因表達量驟降, 在之后4—5 d的胚胎發(fā)育過程中,基因表達量再次呈現(xiàn)上升的趨勢, 這種表達趨勢與家蠶和西方蜜蜂()卵巢發(fā)育中基因表達相似(廖珍, 2009)。在卵巢整個發(fā)育過程中,基因在卵黃發(fā)生晚期與晚期胚胎表達量最高, 推測基因在兩性鹵蟲準備受精的過程和胚胎發(fā)育即將進入不同生殖途徑過程中發(fā)揮著重要作用。

目前沒有雄性鹵蟲精巢相關(guān)的報道, 本研究首次完成了對雄性鹵蟲的生殖發(fā)育周期的探究。與蝦蟹等甲殼動物不同, 鹵蟲發(fā)育周期短, 本研究根據(jù)精巢發(fā)育程度將精巢發(fā)育分為四個時期。雄性鹵蟲精巢從未成熟期到成熟期的發(fā)育過程中,基因表達水平呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢, 且四個時期均存在極顯著差異, 推測基因在雄性鹵蟲精巢發(fā)育前期起著重要作用。相比于其他甲殼動物,基因在中華絨螯蟹精巢中的表達與本研究結(jié)果相似, 即隨著精巢的逐漸發(fā)育,表達量降低(王敏, 2015)。而在三疣梭子蟹()中基因雖在精子細胞的不同發(fā)育階段均有表達, 但其在精子細胞早期、中期和晚期的表達沒有顯著差異, 進一步研究發(fā)現(xiàn)Piwi蛋白主要分布在頂體小管和膜復合物上, 表明其可能在精子發(fā)生過程中發(fā)揮功能(Xiang, 2014)。

piRNAs和Piwi蛋白對于生殖系的形成和維持是必不可少的, piRNA通路受損會導致轉(zhuǎn)座子的過表達, 顯著破壞基因組結(jié)構(gòu), 并導致生殖細胞死亡和不育(Tóth, 2016)。斑馬魚的Ziwi(Houwing, 2007)和Zili (Houwing, 2008)兩種Piwi蛋白對維持生殖系至關(guān)重要, Ziwi在生殖細胞發(fā)育的有絲分裂和早期減數(shù)分裂階段大量表達, Ziwi缺失使幼魚生殖細胞衰竭, 并導致成魚生殖細胞異常凋亡。鹵蟲作為一種良好的實驗動物, 其多種生物學機制如抗逆性和滯育(Liu, 2009)、細胞分裂(Chen, 2016)、發(fā)育分化(Copf, 2004)和繁殖(Dai, 2011)等方面研究已開展較多。本研究利用RNAi技術(shù)探究兩性鹵蟲基因的功能, 對處于卵黃發(fā)生早期的雌性鹵蟲進行顯微注射, 利用qPCR檢測注射后雌性鹵蟲的干擾效率, 結(jié)果顯示基因的干擾效率均在90%左右, 顯微注射很成功。觀察RNAi干擾后雌性鹵蟲產(chǎn)后代的情況, 發(fā)現(xiàn)對照組(ds)和干擾組(ds)胚胎發(fā)育周期都很正常, 然而干擾組由于基因的敲降導致兩性鹵蟲胚胎滯育產(chǎn)生休眠卵。這說明基因的表達量減少可促使雌性鹵蟲胚胎發(fā)育進入卵生生殖途徑,基因在兩性鹵蟲的生殖發(fā)育過程中起到了重要作用, 這可能與兩性鹵蟲的生殖方式?jīng)Q定機制相關(guān)。而在斑節(jié)對蝦中,同源物(Sukthaworn, 2019)和(Sukthaworn, 2020)在斑節(jié)對蝦雌雄生殖腺不同發(fā)育階段均有表達, 且或的敲降都會導致精子數(shù)量的顯著減少, 同樣表明基因可能在斑節(jié)對蝦生殖系發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究為兩性鹵蟲Piwi/piRNA分子機制和功能的后續(xù)研究以及兩性鹵蟲生殖方式方面的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 同時為甲殼動物生殖發(fā)育調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功獲得兩性鹵蟲基因完整的開放閱讀框, 其總長2 619 bp, 編碼872個氨基酸; 生物信息學分析顯示, Piwi蛋白包含PAZ結(jié)構(gòu)域、Piwi結(jié)構(gòu)域和ArgoL1結(jié)構(gòu)域, 二級結(jié)構(gòu)的主體為無規(guī)則卷、α-螺旋和延伸鏈, 且該蛋白主要分布在細胞質(zhì)和細胞核中; 進化樹分析表明兩性鹵蟲與大型溞和蚤狀溞的序列相似性最高; qPCR結(jié)果顯示兩性鹵蟲在生殖腺中均有表達且在發(fā)育不同階段存在差異表達。注射ds后能夠有效抑制兩性鹵蟲基因的表達, 且與對照組相比干擾組后代均產(chǎn)休眠卵。說明基因在兩性鹵蟲的生殖發(fā)育及生殖方式?jīng)Q定過程中起到重要作用。

王 敏, 2015. 中華絨螯蟹()生殖相關(guān)基因的克隆及其表達模式研究. 蘇州: 蘇州大學碩士學位論文, 37—44

王志偉, 2017. 對蝦VEGF信號通路在WSSV感染過程中的功能研究. 北京: 中國科學院大學博士學位論文, 77—79

孫瑜霞, 2014. 鹵蟲休眠胚胎形成過程中相關(guān)基因分子克隆及功能研究. 杭州: 浙江大學碩士學位論文, 2—3

段如冰, 2014. 鹵蟲兩種p90 RSK在調(diào)節(jié)減數(shù)分裂及有絲分裂停滯中功能的研究. 杭州: 浙江大學博士學位論文, 39—44

廖 珍, 2009. 家蠶和蜜蜂中Piwi蛋白基因的克隆與表達譜分析. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文, 28—63

Chen D F, Lin C, Wang H L, 2016. An La-related protein controls cell cycle arrest by nuclear retrograde transport of tRNAs during diapause formation in. BioMed Central Biology, 14(1): 16

Copf T, Schr?der R, Averof M, 2004. Ancestral role ofgenes in axis elongation and segmentation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(51): 17711—17715

Cox D N, Chao A, Baker J, 1998. A novel class of evolutionarily conserved genes defined byare essential for stem cell self-renewal. Genes & Development, 12(23): 3715—3727

Czech B, Hannon G J, 2016. One loop to rule them all: the Ping-Pong cycle and piRNA-guided silencing. Trends in Biochemical Sciences, 41(4): 324—337

Dai Z M, Li R, Dai L, 2011. Determination in oocytes of the reproductive modes for the brine shrimp. Bioscience Reports, 31(1): 17—30

Dattilo A M, Bracchini L, Carlini L, 2005. Estimate of the effects of ultraviolet radiation on the mortality ofin naupliar and adult stages. International Journal of Biometeorology, 49(6): 388—395

Dung N V, Christiaens O, Le Van Bao D, 2019. Identification of RNAi-related genes and transgenerational efficiency of RNAi in. Aquaculture, 501: 285—292

Halajzadeh J, Dana P M, Asemi Z, 2020. An insight into the roles of piRNAs and PIWI proteins in the diagnosis and pathogenesis of oral, esophageal, and gastric cancer. Pathology Research and Practice, 216(10): 153112

Hameed M S, Wang Z B, Vasseur L, 2018. Molecular characterization and the function ofin RNAi pathway of. International Journal of Molecular Sciences, 19(4): 1249

H?ck J, Meister G, 2008. The Argonaute protein family. Genome Biology, 9(2): 210

Houwing S, Berezikov E, Ketting R F, 2008. Zili is required for germ cell differentiation and meiosis in zebrafish. European Molecular Biology Organization Journal, 27(20): 2702—2711

Houwing S, Kamminga L M, Berezikov E, 2007. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell, 129(1): 69—82

Huang X A, Yin H, Sweeney S, 2013. A major epigenetic programming mechanism guided by piRNAs. Developmental Cell, 24(5): 502—516

Ishizu H, Siomi H, Siomi M C, 2012. Biology of PIWI-interacting RNAs: new insights into biogenesis and function inside and outside of germlines. Genes & Development, 26(21): 2361—2373

Kawaoka S, Hayashi N, Suzuki Y, 2009. Theovary-derived cell line endogenously expresses PIWI/PIWI- interacting RNA complexes. RNA, 15(7): 1258—1264

Kim T H, Yun T W, Rengaraj D, 2012. Conserved functional characteristics of the PIWI family members in chicken germ cell lineage. Theriogenology, 78(9): 1948—1959

King A M, MacRae T H, 2012. The small heat shock protein p26 aids development of encystingembryos, prevents spontaneous diapause termination and protects against stress. PLoS One, 7(8): e43723

Klattenhoff C, Theurkauf W, 2008. Biogenesis and germline functions of piRNAs. Development, 135(1): 3—9

Kwon C, Tak H, Rho M, 2014. Detection of PIWI and piRNAs in the mitochondria of mammalian cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 446(1): 218—223

Li C J, Vagin V V, Lee S, 2009. Collapse of germline piRNAs in the absence of Argonaute3 reveals somatic piRNAs in flies. Cell, 137(3): 509—521

Li D R, Ye H L, Yang J S, 2017. Identification and characterization of a() gene involved in sex differentiation in. Gene, 614: 56—64

Liu Y L, Zhao Y, Dai Z M, 2009. Formation of diapause cyst shell in brine shrimp,, and its resistance role in environmental stresses. Journal of Biological Chemistry, 284(25): 16931—16938

Lopes-dos-Santos R M A, Groot R, Sui L Y, 2019. Halophilic bacteria as a food source for the brine shrimp. Aquaculture, 500: 631—639

Manfra L, Savorelli F, Di Lorenzo B, 2015. Intercalibration of ecotoxicity testing protocols with. Ecological Indicators, 57: 41—47

Marie P P, Ronsseray S, Boivin A, 2017. From embryo to adult: piRNA-mediated silencing throughout germline development in. G3: Genes, Genomes, Genetics, 7(2): 505—516

Ozata D M, Gainetdinov I, Zoch A, 2019. PIWI-interacting RNAs: small RNAs with big functions. Nature Reviews Genetics, 20(2): 89—108

Ramat A, Simonelig M, 2021. Functions of PIWI proteins in gene regulation: new arrows added to the piRNA quiver. Trends in Genetics, 37(2): 188—200

Sheu-Gruttadauria J, MacRae I J, 2017. Structural foundations of RNA silencing by Argonaute. Journal of Molecular Biology, 429(17): 2619—2639

Shoji K, Suzuki Y, Sugano S, 2017. Artificial “Ping-Pong” cascade of PIWI-interacting RNA in silkworm cells. RNA, 23(1): 86—97

Sukthaworn S, Panyim S, Udomkit A, 2019. Functional characterization of a cDNA encoding Piwi protein inand its potential roles in controlling transposon expression and spermatogenesis. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A: Molecular & Integrative Physiology, 229: 60—68

Sukthaworn S, Panyim S, Udomkit A, 2020. Homologues of Piwi control transposable elements and development of male germline in. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A: Molecular & Integrative Physiology, 250: 110807

Tamtaji O R, Behnam M, Pourattar M A, 2020. PIWI-interacting RNAs and PIWI proteins in glioma: molecular pathogenesis and role as biomarkers. Cell Communication and Signaling, 18(1): 168

Tóth K F, Pezic D, Stuwe E, 2016. The piRNA pathway guards the germline genome against transposable elements. Non-coding RNA and the Reproductive System, Advances in Experimental Medicine and Biology, 886: 51—77

Wang G L, Reinke V, 2008. A C.Piwi, PRG-1, regulates 21U-RNAs during spermatogenesis. Current Biology, 18(12): 861—867

Xiang D F, Zhu J Q, Hou C C, 2014. Identification and expression pattern analysis of Piwi genes during the spermiogenesis of. Gene, 534(2): 240—248

Xu M G, You Y, Hunsicker P, 2008. Mice deficient for a small cluster of Piwi-interacting RNAs implicate Piwi-interacting RNAs in transposon control. Biology of Reproduction, 79(1): 51—57

Zhou X, Battistoni G, El Demerdash O, 2015. Dual functions of Macpiwi1 in transposon silencing and stem cell maintenance in the flatworm. RNA, 21(11): 1885—1897

THE REPRODUCTIVE REGULATION OFIN BISEXUAL

REN Yi-Zhuo, HAN Xue-Kai, ZUO Jia-Jun, OUYANG Xue-Mei, DUAN Hu, SUI Li-Ying

(Asia Regional Artemia Reference Center,College of Marine and Environmental Sciences, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457, China)

(P-element induced wimpy testis) encoded Piwi protein, and it plays an important role in self-renewal, meiosis, RNA silencing and transcriptional regulation of germ stem cells. To study the role ofin the reproductive development of bisexual, the open reading frame (ORF) ofwas obtained fromtranscriptome, and bioinformatics including sequencing and domain prediction were analyzed. The expression ofin different stages of gonad development ofwere characterized by qPCR, and its function was verified by microinjection RNAi technology. Results showed that the ORF length ofwas 2619 bp, encoding 872 amino acid with a predicted molecular weight of 98.11 kDa, and a theoretical isoelectric point of 9.50. Piwi protein was an alkaline hydrophilic protein containing no signal peptide and transmembrane structure, and included the Piwi and PAZ domains as well as the ArgoL1 domain. The secondary structure was mainly composed of α-helix, which is consistent with the tertiary structure. The phylogenetic tree demonstrated that thesequences ofwere the most similar to those ofandAs shown in the qPCR analysis, theexpression in the later oocytes and later embryos was significantly higher than those of early oocytes and early embryos in ovary (<0.01). The expression level ofin testis was the highest in the immature stage, which was significantly higher than those in early, middle and late maturation stages (<0.01). In addition, applying RNAi (nterference) technology could significantly reduce the expression level of(<0.01) and all offsprings were cysts, suggesting thatgene not only plays an important role in the regulation of reproductive development of, but also may play a key role in determining the reproductive modes of. This study provided basic information for analyses on Piwi/piRNA pathway functions and molecular mechanisms in bisexual, and will help to reveal the role ofin regulating the reproductive mechanism in bisexual.

;gene; gonad; gene expression character; RNAi

* 天津市自然科學基金項目, 18JCQNJC78500號; 天津市科技支撐計劃項目, 17ZXZYNC00060號; 教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃資助項目, IRT-17R81號。任翊卓, 碩士研究生, E-mail: 15732620442@163.com

隋麗英, 博士, 教授, E-mail: suily@tust.edu.cn; 韓學凱, 博士, 助理研究員, E-mail: hanxk@tust.edu.cn

2021-03-16,

2021-04-29

Q789; Q956; S966

10.11693/hyhz20210300069