趙思雨 李躍中 張文元

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)是致密結(jié)締組織，是連接股骨和脛骨的繩狀組織，在穩(wěn)定膝蓋關(guān)節(jié)和正常運(yùn)動(dòng)中起著重要的作用，ACL斷裂無法自愈。移植物植入骨隧道重建ACL是最具挑戰(zhàn)性的臨床問題之一。臨床重建ACL使用的材料包括自體移植物、異體移植物和人工合成材料，但均存在諸多問題。自體移植物供體部位發(fā)生率高，且需二次手術(shù)，并可能伴有功能障礙和不適等問題。異體移植物，存在供體缺乏和免疫排斥，且易傳播疾病和高感染率。人工合成韌帶可以有效地避免供體部位發(fā)生率和疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，盡管短期效果令人滿意，但是長(zhǎng)期隨訪結(jié)果不盡人意，可能導(dǎo)致更高的移植物失敗率和晚期炎性反應(yīng)[1]。

目前應(yīng)用于臨床的人工韌帶結(jié)構(gòu)單一，韌帶在骨隧道中的愈合主要是膠原纖維與骨組織的直接結(jié)合，在結(jié)合部位由于“軟-硬”組織的直接連接缺乏力學(xué)梯度，容易造成應(yīng)力集中，從而導(dǎo)致重建失敗。因此，在軟-硬組織之間實(shí)現(xiàn)功能化的組織學(xué)轉(zhuǎn)變?nèi)允且粋€(gè)難題。組織工程的策略可能會(huì)突破這些限制，為韌帶修復(fù)帶來新的希望。理想的組織工程方法重建ACL主要包含韌帶再生和移植物-骨愈合兩個(gè)方面：①構(gòu)建的組織工程ACL需要有足夠的力學(xué)強(qiáng)度，在植入與替代過程中不斷裂，不過度伸縮；②構(gòu)建的移植物-骨界面止點(diǎn)愈合與否直接關(guān)系到移植的成敗，缺乏生物穩(wěn)固性乃是移植失敗的主要原因[2]。

一、蠶絲的特性

脫膠蠶絲絲素纖維具有良好的生物及細(xì)胞相容性、獨(dú)特而非凡的力學(xué)性能，其斷裂力、彈性模量和拉伸強(qiáng)度與人ACL相當(dāng)。其彈性模量和拉伸強(qiáng)度不受編織纖維數(shù)量的影響，而是受蠶絲的固有性能的影響。另一方面，斷裂力值隨著組成支架的蠶絲數(shù)量的增加而增加，只需增加或減少組成支架的纖維數(shù)量，就能使其更具仿生性[3]。蠶絲與其他生物成分結(jié)合，可增加表面面積，促進(jìn)細(xì)胞黏附，提高生物相容性[4,5]。蠶絲基支架在肌腱/韌帶修復(fù)方面的體內(nèi)研究，如ACL、內(nèi)側(cè)副韌帶、跟腱、肩袖等，已經(jīng)證實(shí)了其潛在的臨床應(yīng)用前景[6]。

近年來，蠶絲憑借其出色的綜合力學(xué)性能和較慢而適當(dāng)?shù)慕到鈺r(shí)間，在眾多的ACL組織工程材料中脫穎而出，為研究者所青睞[7]。蠶絲作為一種蛋白質(zhì)是可降解和吸收的，只是降解時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)[8]。結(jié)合其緩慢的降解速率，由蠶絲絲素纖維蛋白制成的ACL支架在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，可以提供穩(wěn)定性，允許細(xì)胞重建新韌帶組織。實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定屬性的逐漸轉(zhuǎn)移，即可將穩(wěn)定的特性從蠶絲支架移植物轉(zhuǎn)移到新形成的組織中，而不讓病人膝關(guān)節(jié)暴露于不穩(wěn)定的松弛期。因此，蠶絲絲素纖維是組織工程韌帶很有吸引力的候選材料。

二、蠶絲基組織工程前交叉韌帶的構(gòu)建

目前蠶絲的構(gòu)架方式主要有兩類。一類是天然蠶絲脫膠后的蠶絲絲素纖維，編織成多種形狀(如繩索狀、網(wǎng)狀、鞭狀等)后，具有優(yōu)異的承載受力功能，可用于韌帶組織再生[9]。另一類是天然蠶絲脫膠、溶解、過濾、透析從而生成絲素溶液，并進(jìn)一步加工成不同形態(tài)的再生絲素模型(如纖維狀、多孔海綿狀、膜狀等)。再生絲素纖維可以通過濕紡和微流體溶液紡制作獲得，也可用于ACL重建[10, 11]。多孔海綿狀絲素蛋白可以通過凍干、致孔等手段制備，其三維結(jié)構(gòu)恰當(dāng)模擬了機(jī)體生理微環(huán)境的立體結(jié)構(gòu)，可提供種子細(xì)胞生長(zhǎng)場(chǎng)所。

生物材料的三維結(jié)構(gòu)比二維結(jié)構(gòu)更接近體內(nèi)的生理環(huán)境。絲素蛋白的三維結(jié)構(gòu)通常以水凝膠或海綿的形式存在。水凝膠為高含水率，高孔隙率，以便為細(xì)胞遷移和擴(kuò)張?zhí)峁┳銐虻幕ヂ?lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步提高支架性能，蠶絲常與其他天然高分子材料(膠原、明膠、殼聚糖和透明質(zhì)酸)混合使用。大量實(shí)驗(yàn)證明絲素蛋白的加入可完善支架結(jié)構(gòu)，提升支架性能。如使支架生物相容性，力學(xué)性能明顯提升，孔隙分布更加均勻。體內(nèi)外結(jié)果表明，殼聚糖-絲素/聚對(duì)苯二甲酸/銀@羥基磷灰石肌腱通過擴(kuò)大細(xì)胞增殖和上調(diào)肌腱發(fā)育使得細(xì)胞相容性和骨整合得到了根本改善。該肌腱支架是未來ACL置換術(shù)的一個(gè)很有前途的候選者[12]。此外，混合支架可以進(jìn)行物理或化學(xué)交聯(lián)，以改善參數(shù)。目前，許多合成交聯(lián)劑包括甲醛、戊二醛、甘油磷酸和雙醛淀粉等被用于生物材料的改性。

Grabska-Zielinska等[13]以絲素蛋白、膠原蛋白和殼聚糖為基質(zhì)，雙醛淀粉為交聯(lián)劑，制備了三維支架材料。絲素蛋白的加入提高了支架的穩(wěn)定性，同時(shí)雙醛淀粉在不影響支架的微觀結(jié)構(gòu)的前提下，使支架材料的膨脹率與孔隙率得到改善，支架穩(wěn)定性和孔徑規(guī)整性得到進(jìn)一步提升。為滿足ACL重建需求，研究者通常將三維結(jié)構(gòu)的水凝膠或海綿支架負(fù)載到編織支架上使用[14]。韌帶高級(jí)強(qiáng)化系統(tǒng)由聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene glycol terephthalate, PET)制成，是目前用于ACL重建最常用的人工韌帶。但是PET是疏水的，因此很難誘導(dǎo)自體組織的長(zhǎng)入。與單純PET韌帶比較，脫膠絲/PET雜化韌帶保持了更強(qiáng)的誘導(dǎo)自體組織長(zhǎng)入的能力，說明通過絲雜化增強(qiáng)了PET人工韌帶與組織的結(jié)合力[15]。絲素蛋白涂層通過EDC/NHS交聯(lián)可在體內(nèi)外提高PET人工韌帶的生物相容性和促進(jìn)重構(gòu)過程。研究表明絲素蛋白涂層能顯著改善成纖維細(xì)胞的黏附、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)分泌，并可明顯抑制炎性反應(yīng)，促進(jìn)新生組織再生，并在移植物內(nèi)及周圍浸潤梭形細(xì)胞[16]。目前，尚未見人體臨床試驗(yàn)的報(bào)道，但臨床前研究正轉(zhuǎn)向更大的動(dòng)物模型[17]。

天然蠶絲絲素纖維纜索狀支架，雖然力學(xué)性能強(qiáng)健，但內(nèi)部致密，阻礙了細(xì)胞及新生組織長(zhǎng)入[18]。編織的鞭狀結(jié)構(gòu)其空隙性得到了良好的改善。而網(wǎng)狀支架伸縮性和柔軟性良好，可提供足夠的內(nèi)部空間供細(xì)胞及韌帶組織生長(zhǎng)[19]。這幾種編織方式結(jié)合使用，可提高蠶絲基支架的綜合性能。

三、仿生ACL-骨界面止點(diǎn)的構(gòu)建

正常的ACL-骨界面是一個(gè)漸進(jìn)的過程，強(qiáng)調(diào)分層組織區(qū)域是不同的，但在結(jié)構(gòu)上又是連續(xù)的[20]。每一層都表現(xiàn)出一個(gè)典型的細(xì)胞表型和基質(zhì)組成。界面相關(guān)的細(xì)胞群在界面修復(fù)與體內(nèi)平衡中扮演重要角色。從軟組織(韌帶)到硬組織(礦化骨)通過纖維軟骨過渡區(qū)，可以有效地減少骨和彈性韌帶之間的應(yīng)力集中。根據(jù)天然界面的復(fù)雜性，戰(zhàn)略性地生物模擬對(duì)界面再生至關(guān)重要。為了重建這個(gè)多區(qū)域組織，支架界面設(shè)計(jì)必須考慮到再生多種類型的組織，有一個(gè)分層多相的支架是非常必要的。韌帶-骨結(jié)合部構(gòu)建多相支架對(duì)于重建結(jié)合部具有重要的指導(dǎo)意義。

ACL重建術(shù)后早期韌帶張力喪失的原因多種多樣，其中移植物與骨融合緩慢被廣泛認(rèn)為是主要原因。骨隧道內(nèi)肌腱移植物的愈合依賴于骨與肌腱界面的骨長(zhǎng)入或增強(qiáng)肌腱-骨愈合，這對(duì)減少ACL重建后的失敗率非常重要。臨床上，斷裂的韌帶需要修復(fù)到其骨附著處，但末端結(jié)構(gòu)在手術(shù)修復(fù)后通常不能很好地重建，因此韌帶-骨界面整合是評(píng)價(jià)ACL重建效果的重要指標(biāo)。Ran等[21]先將蠶絲膠原支架皮下植入2周，然后使支架一端游離轉(zhuǎn)移，在不中斷血液灌注的情況下重建兔ACL。重建后2周，骨和支架之間有較多的纖維結(jié)締組織產(chǎn)生。重建后4周和12周，形成典型的韌帶-骨界面和纖維軟骨層。支架與骨之間沒有明顯的縫隙，骨隧道內(nèi)出現(xiàn)大量的礦化組織。

Qing等[22]制備了鋰藻土-蠶絲支架并重建兔ACL，鋰藻土的加入改善了蠶絲的力學(xué)性能，與單純蠶絲支架比較，骨隧道段周圍產(chǎn)生了更多的新骨組織，減小了骨隧道。另一方面，含有鋰藻土的支架可以促進(jìn)纖維軟骨組織和成熟的膠原纖維的形成，促進(jìn)了移植物的骨整合過程。Teuschl等[23]對(duì)綿羊行ACL切除，分別使用蠶絲支架和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyml stem cell, BMSCs)復(fù)合蠶絲支架重建ACL。絲質(zhì)支架由于其特殊的力學(xué)性能和生物相容性，在人ACL重建中顯示出很高的潛力。ACL界面恢復(fù)效率低下被認(rèn)為是常見的絲基韌帶移植物的主要障礙。Fan等[24]通過將分層方法和基因固定化相結(jié)合，開發(fā)了一種基因固定化三聯(lián)絲支架來增強(qiáng)ACL骨整合?；蚬潭ǖ娜嘟z支架顯著促進(jìn)BMSCs的增殖和向相應(yīng)細(xì)胞系分化。結(jié)果表明，采用分層方法和基因固定化有效加快了絲介導(dǎo)的ACL界面形成，擴(kuò)大了絲基韌帶移植物用于ACL重建的治療潛力。

Font等[25]制備了雙相絲素蛋白支架，用以模擬界面膠原分子排列的梯度。支架有兩種不同的孔排列，在肌腱/韌帶側(cè)是各向異性的，在骨側(cè)是各向同性的。雙相支架支持細(xì)胞附著，能夠更好地支持功能性組織再生，允許肌腱/韌帶和骨之間的機(jī)械應(yīng)力逐步轉(zhuǎn)移。PET人工韌帶的生物相容性較差，可能導(dǎo)致ACL重建后關(guān)節(jié)內(nèi)和骨內(nèi)愈合不良。通過絲素蛋白和羥基磷灰石分段涂層觀察對(duì)PET韌帶移植物結(jié)扎和骨整合過程的影響。體內(nèi)研究表明，分段涂層可以提高移植物韌帶化和骨整合過程。因此，絲素蛋白和羥基磷灰石分段涂層在臨床增強(qiáng)ACL重建手術(shù)及移植物-骨愈合中可能有很大的應(yīng)用潛力[26]。Zhi等[27]研究表明,采用種植兔BMSCs的電紡絲纖維墊包裹可促進(jìn)移植軟組織的肌腱-骨愈合。

四、展 望

隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，證明蠶絲支架在保證力學(xué)性能的同時(shí)，能促進(jìn)移植物愈合。BMSCs和成纖維細(xì)胞等表現(xiàn)出與支架的相容性，并已被證明可以增加組織膠原蛋白的產(chǎn)生。使用生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)衍生物可以增強(qiáng)這些效應(yīng)。蠶絲是一種易于加工的生物聚合物，這使得以絲為基礎(chǔ)的生物材料被塑造成不同的形式和結(jié)構(gòu)。絲蛋白作為生物材料的選擇不僅是由于其自然聚合、機(jī)械魯棒性、靈活性和廣泛的細(xì)胞相容性，還因?yàn)樗梢龑?dǎo)羥基磷灰石(骨礦物質(zhì)基質(zhì)的主要無機(jī)成分)增長(zhǎng)的能力，從而改善骨整合。

蠶絲支架雖然目前在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，但真正應(yīng)用于臨床還有很長(zhǎng)的路要走。未來蠶絲組織工程韌帶的發(fā)展方向，一方面可以提高和改善蠶絲性能和蠶絲支架結(jié)構(gòu)，更好地與種子細(xì)胞相結(jié)合，并可與生長(zhǎng)因子或其他材料聯(lián)合應(yīng)用，以滿足臨床中ACL修復(fù)的更高需求。另一方面，可以改善手術(shù)方式，先將蠶絲支架預(yù)血管化，模擬關(guān)節(jié)外炎癥刺激，以促進(jìn)血管和細(xì)胞的早期生長(zhǎng)。另外，也可以先體外培養(yǎng)ACL來源的干細(xì)胞，蠶絲支架重建ACL后，行細(xì)胞關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，以更好地促進(jìn)骨-韌帶-骨再生，抑制骨關(guān)節(jié)炎。在目前可用的各種天然和合成聚合物中，蠶絲在各個(gè)醫(yī)療/制藥領(lǐng)域表現(xiàn)出了巨大的前景，這將繼續(xù)為未來組織工程、藥物輸送、生物傳感和制造技術(shù)等方面的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。