孟淑娟

遼寧省朝陽市疾病預(yù)防控制中心微生物檢測所 122000

流感是全世界最嚴(yán)重的呼吸道傳染病之一，其發(fā)病率極高，因此流感是第一個實現(xiàn)全球監(jiān)控的傳染病。流行性感冒病毒是正黏病毒科的代表種，簡稱流感病毒，包括人流感病毒和動物流感病毒，人流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原體。甲型流感病毒常以流行形式出現(xiàn)，引起世界性流感大流行，它在動物中分布廣泛，并也能在動物中引起流感流行和造成大量動物死亡。乙型流感病毒常引起流感局部爆發(fā)，不引起世界性流感大流行。丙型流感病毒主要以散在形式出現(xiàn)，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行。流感在流行病學(xué)上最顯著的特點為：突然爆發(fā)，迅速蔓延，波及面廣，具有一定的季節(jié)性，一般流行3～4周會自然停止，發(fā)病率高死亡率低，多發(fā)于青少年，恢復(fù)快，一般不留后遺癥，每次流行后都要在人群中造成不同程度的超額死亡，因此流感在疾病預(yù)防控制中是一項非常重要的常規(guī)監(jiān)測項目。目前我國省市級流感監(jiān)測實驗室常采用MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)來分離流感毒株，對流感的型別進(jìn)行鑒別，以便更好地掌握流感的流行病學(xué)特點，也同時為流感疫苗的制備提供依據(jù)[1]。該文主要通過MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)來分析流感病毒陽性樣本在增毒過程中的影響因素，從而提高流感組織培養(yǎng)技能，為疫苗制備提供更充足的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 細(xì)胞由遼寧省疾病預(yù)防控制中心提供。一般采用MDCK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，一般選取30代以內(nèi)的細(xì)胞，30代之后的細(xì)胞由于敏感性下降，對流感病毒已經(jīng)不敏感，不建議使用。如果情況特殊需要使用，需要做TCID50敏感性測定。

1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)液及小牛血清試劑購于美國Gibco公司，青霉素鏈霉素混合劑(PS)、胰酶-EDTA、PBS、牛血清白蛋白組分V(ALB)購于以色列BioInd公司，TPCK胰酶購于美國SIGMA公司，流感病毒標(biāo)準(zhǔn)血清由國家疾控中心提供。豚鼠血紅細(xì)胞懸液由朝陽市衛(wèi)生健康事業(yè)服務(wù)中心流感實驗室制備。生理鹽水購于山東科倫藥業(yè)有限公司。

1.3 樣本 樣本來自2017年9月—2020年3月遼寧省朝陽市中心醫(yī)院發(fā)熱門診的流感樣病例(發(fā)熱、腋下體溫≥38℃，伴咳嗽或者咽痛且未服用過抗病毒藥物的患者，采樣時間距離就診時間不超過3d)，且經(jīng)PCR實驗室檢測流感病毒核酸陽性的115份樣本。

2 方法

2.1 MDCK細(xì)胞分離流程 用40倍鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，選擇處于對數(shù)期的MDCK細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)。將細(xì)胞板用PBS清洗3次，然后將200μl的樣本接種到24孔細(xì)胞板，然后加入配置好的病毒生長液，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如果是第1次上樣應(yīng)將樣本接種后放入溫箱孵育1.5h，然后取出細(xì)胞板用PBS清洗3次再加入病毒培養(yǎng)液。觀察細(xì)胞病變，記錄每天細(xì)胞的病變情況，當(dāng)出現(xiàn)明顯病變時進(jìn)行收獲，如果沒有病變也應(yīng)在第7天收獲。收獲后進(jìn)行紅細(xì)胞凝集實驗(HA)，HA滴度達(dá)到1∶16時進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制實驗(HI)，HA滴度沒有達(dá)到1∶16則繼續(xù)進(jìn)行增毒，一般增毒3次或者4次還沒達(dá)到滴度需要重新上樣，防止增毒次數(shù)太多導(dǎo)致病毒變異。

2.2 樣本處理 實驗室收到樣本后，需進(jìn)行處理后再進(jìn)行病毒分離接種。先將含聚丙烯纖維的拭子在管壁反復(fù)擠壓后取出，然后將標(biāo)本分成3份，每份1ml。1份用于雞胚培養(yǎng)，1份用于MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)，1份用于保存待復(fù)核。

2.3 TPCK胰酶的最佳濃度 選取PCR檢測陽性樣本115份，等量接種到24孔細(xì)胞板中，然后每個孔分別加入胰酶(2mg/ml TPCK)終濃度為1、2、3、5、10μg/ml的病毒維持液，采用相同條件放入CO2培養(yǎng)箱，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時進(jìn)行收獲，一般72h會出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，此時可以進(jìn)行病毒液收獲。

2.4 流感病毒最佳增值代數(shù) 選取PCR檢測陽性樣本115份，將115份樣本分5次以200μl接種到生長成致密單層的MDCK24孔細(xì)胞板，然后每次收獲之后連續(xù)傳6代，每一代收獲病毒液之后測定HA的滴度并記錄每一次HA實驗結(jié)果。

2.5 病毒液最佳稀釋倍數(shù) 選取PCR檢測陽性樣本115份，每次上樣后記錄HA滴度。HA滴度為1∶1的樣本13份，HA滴度為1∶2的樣本26份，HA滴度為1∶4的樣本有61份，HA滴度為1∶8的樣本15份。選取61份HA滴度1∶4 的樣本，分別以1∶1、1∶100、1∶200、1∶500進(jìn)行稀釋。將稀釋后的樣本分別接種200μl到24孔細(xì)胞板，放入溫箱培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時進(jìn)行收獲，一般72h會出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，此時可以進(jìn)行病毒液收獲。

3 結(jié)果

3.1 TPCK胰酶的最佳濃度 維持液中加入適量胰酶的目的是為了提高流感病毒在細(xì)胞中感染性，能促進(jìn)流感病毒空斑的形成，加大空斑面積。因為只有血凝素(HA)是裂解型的流感病毒，其毒粒才具有感染性。細(xì)胞培養(yǎng)不同于雞胚培養(yǎng)，它的維持液中不存在蛋白水解酶，無法將病毒粒非裂解型的HAO變成裂解型的HA1+HA2，故必須要在維持液中加入適量的胰酶，實驗中發(fā)現(xiàn)胰酶在維持液中終濃度為2.5mg/ml時病毒液的HA滴度會明顯提高。

3.2 流感病毒增值最佳代數(shù) 根據(jù)HA實驗結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，在病毒接種之后進(jìn)行第3次傳代增毒的時候，HA的滴度最高，有62份樣品HA滴度均達(dá)到1∶32，其余48份樣品HA滴度也能夠達(dá)到1∶16，只有5份樣本HA滴度低于1∶16。而第1代僅有12份樣本HA滴度1∶8，其余103份樣本HA滴度均低于1∶8，第2代有38份樣本HA滴度1∶16，其余77份樣本HA滴度均低于1∶16。當(dāng)進(jìn)行到第四次細(xì)胞接種增毒之后，發(fā)現(xiàn)滴度明顯下降，甚至出現(xiàn)沒有滴度的情況，說明病毒增毒的最佳代數(shù)是在進(jìn)行第3次傳代增毒，所以我們在增毒過程中一般以3代為主，再繼續(xù)傳代不僅滴度下降，還有可能使病毒產(chǎn)生變異。

3.3 病毒液最佳稀釋倍數(shù) 實驗發(fā)現(xiàn)，病毒在第1次接種培養(yǎng)之后有53%的樣本HA滴度可以達(dá)到1∶4，需要繼續(xù)傳代細(xì)胞進(jìn)行接種，當(dāng)流感病毒毒力太強，接種到細(xì)胞上容易引起細(xì)胞提前脫落，不能夠有效增殖。在61份滴度達(dá)到1∶4的樣本中有38份都在1∶200的稀釋倍數(shù)時獲得的滴度均>1∶16，其他23份樣本有5份樣本在1∶1稀釋倍數(shù)時、13份樣本在1∶100稀釋倍數(shù)時、5份樣本在1∶500稀釋倍數(shù)時獲得的滴度>1∶16，故一般1∶4滴度的病毒液應(yīng)該按1∶200比例進(jìn)行稀釋后是最適合病毒在MDCK細(xì)胞上增殖，這樣我們可以及時對樣本進(jìn)行準(zhǔn)確的稀釋來提高HA滴度，獲得更多的流感毒株。

4 討論

流感的MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定是當(dāng)今流感診斷和流行判斷最可靠的一種方法[2]，此外流感病毒PCR核酸檢測也有重要的意義，它能夠快速、準(zhǔn)確地診斷出陽性毒株，并且進(jìn)行準(zhǔn)確的分型，同時對MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)有重要的參考意義[3]。關(guān)于PCR檢測中的Ct值對MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)有哪些參考價值也值得深入探討，包括Ct值的高低對陽性檢出率的影響等。

MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)增毒過程中，還有很多因素可以影響病毒的增殖，如選擇細(xì)胞的代數(shù)、狀態(tài)、疏密程度及操作者的操作手法等，這就要求實驗人員有較豐富的經(jīng)驗和熟練的操作手法，還要有嚴(yán)格的無菌操作過程以避免實驗過程中造成污染[4]。

流感病毒的組織培養(yǎng)工作最主要的目的是獲得流感毒株并且進(jìn)行流感毒株的分型[5]，這樣可以方便我們掌握好每一個流感流行季節(jié)的流感動態(tài)趨勢。通過我們的工作可以清楚地知道每年流行哪一個類型的流感病毒，也能夠及時發(fā)現(xiàn)每個年度出現(xiàn)的新變異株，尤其是大流行株。流感病毒具有極強的變異性，抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變使它經(jīng)常出現(xiàn)新的變異毒株，造成全球大面積地區(qū)的流行，因此流感疫苗也需要年年接種，而不能達(dá)到一針見效或者是終身免疫的效果，也正因為流感超強的變異性給流感疫苗的研發(fā)制作帶來了很大的難度。流感疫苗制備必須一直要根據(jù)監(jiān)測的流感流行動態(tài)來進(jìn)行不斷的調(diào)整和更新。工作中，一旦發(fā)現(xiàn)流感的新變異株時，就需要立刻引起高度重視，及時將培養(yǎng)出的新變異株上送至國家基本預(yù)防控制中心，這樣才能保證及時調(diào)整疫苗的生產(chǎn)制作，也只有不斷調(diào)整疫苗的生產(chǎn)制作才能夠針對流感病毒的變異性發(fā)揮出最大的作用，最大限度地提高人體對流感病毒的免疫力，降低流感病毒的死亡率。

關(guān)于流感病毒的分離培養(yǎng)還有很多問題需要進(jìn)一步探討和研究，比如流感不同型別的毒株分離培養(yǎng)的特點等，希望能夠不斷探討，不斷提高流感檢測技能，也希望能夠利用不斷完善的理論知識去指導(dǎo)實踐工作，讓流感病毒組織培養(yǎng)工作實現(xiàn)更大的社會價值。