姚宇 施昌勁 吳剛 孫平 馮劍穎*

組蛋白Histatin是一組富含組氨酸的小分子、陽(yáng)離子同源多肽，由腮腺、下頜下和舌下腺的漿液性腺泡分泌，在人和高等靈長(zhǎng)類動(dòng)物的唾液中表達(dá)，具有廣譜抗菌活性［1］?，F(xiàn)已分離出12種Histatin，即Histatin 1～12［2］。Histatin 1（Hst 1）和 Histatin 3（Hst 3）分別是由基因HIS1和HIS2編碼的全長(zhǎng)產(chǎn)物，其余組蛋白均由Hst 1和Hst 3蛋白水解切割產(chǎn)生［3］。Hst 1在人類唾液的組蛋白中含量最多，具有促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)散、遷移、粘附和抗菌等作用。近年來(lái)，有學(xué)者檢測(cè)到Hst 1在除口腔外的其他組織中表達(dá)，如淚腺和副淚腺、黑色素瘤細(xì)胞系［4-5］等。本文重點(diǎn)介紹Hst 1的主要生物學(xué)功能、信號(hào)傳導(dǎo)通路，為Hst 1的臨床應(yīng)用前景提供思路。

1 組蛋白Hst 1分子結(jié)構(gòu)

Hst 1是具有兩親性的陽(yáng)離子肽，包含38個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為：DSHEKRHHGYRRKFHEKHHSHREFPFYGDYGS NYLYDN。天然條件下，Hst 1分子結(jié)構(gòu)為有規(guī)律的α-螺旋和β-折疊，其蛋白結(jié)構(gòu)的Ser2區(qū)磷酸化后，可具有多種生物學(xué)功能［6］。OUDHOFF［7］等利用氨基酸逐步截短法，發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)Hst 1促進(jìn)傷口閉合的最小結(jié)構(gòu)域?yàn)镾HREFPFYGDYGS。將氨基酸首尾端共價(jià)連接環(huán)化Hst 1，可增強(qiáng)其促進(jìn)細(xì)胞遷移、粘附的能力，表明Hst 1的空間結(jié)構(gòu)影響其對(duì)細(xì)胞的激活。

2 組蛋白Hst 1生物學(xué)功能及機(jī)理

2.1 促進(jìn)細(xì)胞粘附 （1）促進(jìn)細(xì)胞-基底粘附：OUDHOFF［7］和SUN［8］通過(guò)測(cè)定細(xì)胞絲狀偽足和片狀脂蛋白表面積，發(fā)現(xiàn)Hst 1促進(jìn)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞在玻璃基底上的粘附。研究證實(shí)，Hst 1不僅可促進(jìn)上皮細(xì)胞與基底的粘附速度，還可將其與基底的粘附強(qiáng)度提高30%。VAN DIJK等［9］通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法，證實(shí)Hst 1促進(jìn)成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞在鈦基底和羥基磷灰石上粘附，其中成骨細(xì)胞對(duì)鈦的粘附速度提高1.5倍。其機(jī)制在于Hst 1提高細(xì)胞中F肌動(dòng)蛋白含量，增加半橋粒的形成，從而促進(jìn)細(xì)胞-基底粘附。（2）促進(jìn)細(xì)胞間粘附：VAN DIJK等［10］通過(guò)豬鏈球菌跨單層上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Hst 1抑制細(xì)胞旁路途徑。研究證明，Hst 1將上皮細(xì)胞的跨上皮電阻提高20%［11］，表明Hst 1促進(jìn)細(xì)胞間的粘附，形成上皮屏障。Hst 1通過(guò)提高細(xì)胞中E-cad、occuldin、Claudin、ZO-1蛋白含量，增加橋粒和緊密連接蛋白形成，從而促進(jìn)細(xì)胞間粘附。

TGFβ和EGF是誘導(dǎo)腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的細(xì)胞因子，下調(diào)細(xì)胞中E-cad和ZO-1表達(dá)。有學(xué)者證明，在含有TGFβ和EGF培養(yǎng)基中加入Hst 1，鱗狀上皮癌球體表面積減小1/3，球體形態(tài)更緊湊，提示Hst 1通過(guò)增強(qiáng)球體內(nèi)細(xì)胞間相互粘附，抵消EMT驅(qū)動(dòng)因子對(duì)細(xì)胞連接的抑制作用，延緩癌細(xì)胞脫落轉(zhuǎn)移［10］。

2.2 促進(jìn)細(xì)胞遷移 近年來(lái)已有研究通過(guò)記錄細(xì)胞遷移路徑、Boyden、Transwell、體外劃痕實(shí)驗(yàn)等多種實(shí)驗(yàn)方法證明，Hst 1可促進(jìn)黏膜、牙齦、角膜和皮膚等不同來(lái)源的各種上皮細(xì)胞遷移［9-11］，提升內(nèi)皮細(xì)胞、牙齦成纖維細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞的遷移能力［6-8］。研究證明，Hst 1促進(jìn)細(xì)胞前端形成樹突，增加細(xì)胞中微絲含量，形成新的細(xì)胞附著，提高細(xì)胞收縮力，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移［8-10］。有學(xué)者利用炎癥因子、紫外線、雙磷酸鹽，分別抑制成纖維細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞的遷移，發(fā)現(xiàn)Hst 1將細(xì)胞遷移能力恢復(fù)至原有水平［12-13］。YAGUCHI等［5］在黑色素瘤細(xì)胞中檢測(cè)到Hst 1的表達(dá)，通過(guò)siRNA降低黑色素瘤細(xì)胞中Hst 1的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞遷移能力降低。

2.3 抑制細(xì)胞凋亡 研究發(fā)現(xiàn)，在正常環(huán)境中Hst 1不參與細(xì)胞凋亡進(jìn)程的調(diào)節(jié)［14］。在異常不良環(huán)境中，如紫外線、雙磷酸鹽等不利環(huán)境，Hst 1可抑制角膜上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞的凋亡［12-13］。研究證明，Hst 1通過(guò)上調(diào)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2的表達(dá)，抑制下游凋亡蛋白Caspase-3的激活，從而抑制細(xì)胞在異常不良環(huán)境中凋亡。

2.4 抗菌及抗真菌 Hst 1為陽(yáng)離子型多肽，中和微生物膜的負(fù)電荷，導(dǎo)致細(xì)胞膜透化，細(xì)菌失去膜勢(shì)而死亡。有學(xué)者通過(guò)瓊脂糖彌散抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Hst 1對(duì)變形鏈球菌和金黃色葡萄球菌有抗菌活性。變形鏈球菌是主要的致齲菌之一。MACKEY等［15］研究發(fā)現(xiàn)，Hst 1在體外能抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)和活力，且靜止期的變形鏈球菌對(duì)Hst 1更敏感。PEDRO等［16］利用吸光度實(shí)驗(yàn)，證明Hst 1通過(guò)破壞靶細(xì)胞磷酸酯膜，促進(jìn)白色念珠菌及其孢子凋亡，起到抗真菌作用。

2.5 促血管生成 CASTRO等［13］通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)和雞胚絨尿囊膜實(shí)驗(yàn)，記錄血管網(wǎng)絡(luò)形態(tài)，量化血管生成數(shù)量，發(fā)現(xiàn)Hst 1增加血管網(wǎng)絡(luò)形成，提高血管生成數(shù)量，促進(jìn)體外血管形態(tài)發(fā)生，體內(nèi)血管生成，其促進(jìn)血管生成效果與VEGF效果相似，是一種新型促血管生成因子。研究證實(shí)，Hst 1通過(guò)增加活性Rac1含量，激活血管生成信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞中VEGF、FGF2、CD105和CD31的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和粘附能力，促進(jìn)血管生成［16-17］。

2.6 預(yù)防齲齒，促進(jìn)再礦化 有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)齲者唾液中Hst 1含量高于患齲率高的患者，提示Hst 1與低患齲率相關(guān)［18］。Hst 1是獲得性牙釉質(zhì)薄膜的組成蛋白之一。細(xì)菌在牙齒表面代謝時(shí)產(chǎn)酸，Hst 1中富含組氨酸分子，其包含的咪唑環(huán)中和細(xì)菌產(chǎn)生的酸，調(diào)節(jié)牙菌斑的pH值，阻止羥基磷灰石中的鈣流失，抑制牙釉質(zhì)脫礦，在齲病發(fā)生早期階段起到防齲作用［19-20］。通過(guò)液閃測(cè)量實(shí)驗(yàn)，證實(shí)Hst 1在口內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性抑制高分子量糖蛋白吸附于羥基磷灰石表面，減少變形鏈球菌對(duì)牙釉質(zhì)表面的粘附，降低齲病的發(fā)生［21］。MARGOLIS［3］研究發(fā)現(xiàn)Hst 1抑制磷酸鈣的沉積，使唾液處于磷酸鈣過(guò)飽和狀態(tài)，未治療的早期齲病病變吸收唾液中的Ca2+，促進(jìn)病變?cè)俚V化。

3 Histatin 1 相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路

3.1 細(xì)胞遷移信號(hào)通路 細(xì)胞遷移相關(guān)的信號(hào)通路有MARK/ERK1/2、PI3K/AKT、Wnt3a、Jake/STAT、SMAD等。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Hst 1具有提高內(nèi)皮細(xì)胞中磷酸化ERK1/2水平，促進(jìn)細(xì)胞遷移［16］。MAPK/ERK信號(hào)通路阻斷劑U0126可抑制Hst 1促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的能力［22］，提示Hst 1通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。

PEDRO等［16］通過(guò)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、western blot、poll-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Hst 1促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中RIN2含量增加，激活Rab5，進(jìn)而促進(jìn)Rac1磷酸化，通過(guò)上調(diào)磷酸化ERK1/2含量表達(dá)，激活MAPK/ERK信號(hào)通路。利用siRNA抑制內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)RIN2，進(jìn)一步證實(shí)Hst 1通過(guò)Rin2-Rab5-Rac1信號(hào)軸激活內(nèi)皮細(xì)胞MAPK/ERK信號(hào)通路，從而促進(jìn)其遷移。OUDHOFF［7］通過(guò)上皮細(xì)胞傷口閉合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)百日咳毒素作為G蛋白偶連受體抑制劑，抑制Hst 1對(duì)上皮細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用，減少細(xì)胞內(nèi)ERK1 1/2含量，提示Hst 1也可通過(guò)G蛋白偶連受體激活MAPK/ERK。DANDAN等［23］通過(guò)免疫熒光染色和共聚顯微鏡，發(fā)現(xiàn)Hst 1在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有共同定位，提示Hst 1通過(guò)促進(jìn)線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)偶連，激活重塑細(xì)胞骨架、微絲收縮，并促進(jìn)線粒體呼吸，提供細(xì)胞遷移和粘附所需能量，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移與粘附。

3.2 抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路 Bcl-2是第一個(gè)被確認(rèn)能對(duì)抗細(xì)胞凋亡的基因。HUANG［12］通過(guò)RT-PCR證實(shí)，Hst 1增加細(xì)胞中Bcl-2 mRNA及蛋白含量，下調(diào)Bax mRNA及蛋白含量，抑制紫外線誘導(dǎo)的角膜上皮細(xì)胞凋亡。Caspase3具有剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白作用，是細(xì)胞凋亡最終執(zhí)行分子。CASRTO等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Hst 1降低磷酸化Caspase3蛋白含量，抑制雙磷酸鹽誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。提示在異常不良環(huán)境中，Hst 1通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2表達(dá)，激活Bcl-2/Bax/Caspase3信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡。

4 小結(jié)

Hst 1是一種多功能肽，具有促進(jìn)細(xì)胞遷移、粘附、抗菌及抗真菌、抑制細(xì)胞凋亡、促血管生成、防齲等作用，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中具有巨大潛力。Hst 1在臨床應(yīng)用前景如下：（1）Hst 1作為組蛋白家族中最有效的體外創(chuàng)口閉合劑，是人唾液中促進(jìn)口腔角質(zhì)形成、創(chuàng)口閉合的主要因子。作為創(chuàng)口修復(fù)劑，可促進(jìn)皮膚創(chuàng)口的再上皮化、口內(nèi)黏膜創(chuàng)口愈合、角膜缺損的修復(fù)、血管生成；（2）利用其抗菌及抗真菌特性，可預(yù)防創(chuàng)口感染；（3）應(yīng)用于骨科及口腔植入物，改善植入物與骨組織的整合。促進(jìn)牙齦與口腔種植體基臺(tái)的粘附，阻止微生物侵入，提高種植成功率；（4）應(yīng)用于早期齲病的預(yù)防及治療，抑制齲病進(jìn)展，促進(jìn)脫礦牙釉質(zhì)再礦化。

Hst 1抵消腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化驅(qū)動(dòng)因子作用，可增強(qiáng)癌細(xì)胞間相互粘附，為抑制癌癥轉(zhuǎn)移提供潛在的可能性，特別是以E-cad水平為轉(zhuǎn)移決定因素的口腔鱗癌。研究Hst 1在腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展中的作用及機(jī)制將是學(xué)者們今后研究的熱點(diǎn)和方向。