張譯之，張曉慧 綜述，陳 煜 審校

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease ，NAFLD)是指與過量飲酒無關(guān)的，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征[1]。NAFLD疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化、NAFLD相關(guān)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，疾病過程通常伴隨脂肪增加、體質(zhì)量增加、胰島素抵抗、血脂異常，組織學(xué)可見肝脂肪變性、小葉炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變、細(xì)胞周圍纖維化等。全球NAFLD的患病率逐年增高。目前，亞洲患病率為27%[2]，尚缺乏用于NAFLD的有效藥物，也缺乏精準(zhǔn)的方法識別NAFLD和NASH危險人群，還缺乏模擬疾病和測試新藥的最佳體外模型，因此構(gòu)建合適的肝脂肪變性實驗?zāi)Ｐ途哂兄匾囊饬x。

1 動物模型

NAFLD動物模型可分類為遺傳模型、營養(yǎng)模型、遺傳和營養(yǎng)因子的組合模型[3]。

1.1 基因敲除或基因突變模型 1) ob/ob 小鼠和 db/db 小鼠模型。db/db小鼠是常染色體隱性糖尿病基因(db)的純合子。該基因編碼瘦素受體(Ob-Rb)的點突變，導(dǎo)致瘦素信號缺陷。db/db小鼠的瘦素水平無異常，但卻伴有瘦素抵抗。這些小鼠攝食量多，伴嚴(yán)重的肥胖、糖尿病和高胰島素血癥，肝臟病理表現(xiàn)為肝脂肪變性(大泡性)[4]。與db/db小鼠不同，ob/ob小鼠的瘦素編碼基因(ob基因)突變，表現(xiàn)為瘦素合成障礙。這些小鼠同樣存在超重、高攝食狀態(tài)、高胰島素血癥、高糖血癥和胰島素抵抗，病理也存在自發(fā)性肝脂肪變性。早在1997年[5]，人們就發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠在正常對照飲食中不會自發(fā)產(chǎn)生炎癥，如果給ob/ob小鼠第二次“打擊”，如注射細(xì)菌脂多糖，可誘發(fā)脂肪性肝炎。同樣地，給db/db小鼠缺乏蛋氨酸和膽堿(MCD)飲食干預(yù)或攝入反式脂肪，可以在NAFLD的基礎(chǔ)上誘發(fā)NASH。不同的是，ob/ob小鼠有抵抗肝纖維化的能力，因為在肝纖維化過程中需要瘦素的參與[6]；2)PTEN基因敲除小鼠。人類第10號染色體缺失的編碼與磷酸酶和張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10, PTEN)是一種重要的抑癌基因，它影響PI3K/Akt/mTOR途徑和胰島素信號途徑，是肝臟脂肪生成、葡萄糖代謝和腫瘤發(fā)生的重要介質(zhì)[7，8]。肝特異性PTEN基因敲除的小鼠發(fā)展為NAFLD，對胰島素高敏感[9]。肝臟組織形態(tài)學(xué)不只可見大脂滴性脂肪肝、肝細(xì)胞腫脹、小葉內(nèi)炎性細(xì)胞漫潤等酷似人NASH的病理組織學(xué)改變，而且完全可以重現(xiàn)“脂肪肝-脂肪性肝炎-肝纖維化-肝癌”的自然經(jīng)過。研究表明66%肝細(xì)胞特異性PTEN基因敲除小鼠在74～78周齡時可發(fā)展為自發(fā)性肝癌[10]。因此，該模型常用來探索NASH以及相關(guān)HCC進(jìn)展的機(jī)制；3)SREBP-1c轉(zhuǎn)基因小鼠。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol response element -binding protein 1c，SREBP-1c)是一種轉(zhuǎn)錄因子，影響脂質(zhì)代謝。SREBP-1c轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為肝脂肪變性、胰島素抵抗，小葉炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變和細(xì)胞周圍纖維化[11]。然而，該模型白色脂肪組織質(zhì)量減少，循環(huán)瘦素水平低，因此其應(yīng)用受到了與ob/ob小鼠相似的限制。此外，該小鼠在正常飲食20周后，會出現(xiàn)靜脈及細(xì)胞周圍纖維化，但整個疾病過程中沒有肥胖的發(fā)生[11]。

1.2 營養(yǎng)、藥物誘發(fā)模型 1)高脂飲食模型。高脂飲食(high-fat diet，HFD)模型所構(gòu)建的NAFLD模型可以較好地反映人類NAFLD肝臟組織病理學(xué)。經(jīng)典的HFD飲食能量來源組成為脂肪占比71%、碳水化合物11%、蛋白質(zhì)18%。給予雄性C57BL/6[12]小鼠HFD喂養(yǎng)16周，結(jié)果HFD小鼠出現(xiàn)肝脂肪變性、TG水平升高、肝細(xì)胞氣球變，并出現(xiàn)胰島素抵抗。SD大鼠對高脂飲食更敏感，且雄性大鼠更易發(fā)生肝細(xì)胞脂肪變。Solinas et al[3]用雄性SD大鼠HFD飲食1～4周，與人脂肪肝的肝臟組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFD動物模型與人類脂肪肝的相應(yīng)階段有著密切的相似性。2016年，Asgharpourde et al[13]給予HFD動物不限制葡萄糖和果糖，可依次發(fā)展為NAFLD、NASH、進(jìn)行性纖維化和HCC。然而，NASH的形成需要16周，晚期纖維化的形成需要36周。此外，肝癌的發(fā)生頻率遠(yuǎn)高于人類；2)高膽固醇飲食(high cholesterol diet，HCD)模型。飲食中的膽固醇是動物模型[14]NAFLD進(jìn)展為NASH的關(guān)鍵因素。單用HCD喂養(yǎng)的小鼠胰島素水平升高，但肝質(zhì)量、甘油三酯水平和血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平僅輕微升高[15]。然而，當(dāng)高膽固醇與高脂肪結(jié)合時，有更明顯的NASH表現(xiàn)：小鼠體質(zhì)量增加、肝臟脂質(zhì)積聚增加、血清ALT水平升高、脂聯(lián)素水平降低、炎癥增加和纖維化，并且這些特征比在HFD或HCD小鼠中更為明顯。同樣地，高膽固醇、高膽酸鹽飲食小鼠也表現(xiàn)出脂肪變性、炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變和纖維化[16, 17]。有研究表明，膳食膽固醇降低脂肪酸的VLDL合成和β-氧化，增加細(xì)胞凋亡和肝臟氧化應(yīng)激[18]；3)高果糖飲食模型。 人類從富含果糖的食物中攝入大量熱量，影響了肥胖和NASH的發(fā)展[19]。C57BL/6小鼠喂食HFD或高脂高果糖(high-fat high-fructose，HFHF)飲食，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組小鼠的體質(zhì)量增加、體脂含量、胰島素抵抗和肝脂肪變性相似，HFHF小鼠肝臟巨噬細(xì)胞數(shù)量、轉(zhuǎn)化生長因子水平、肝氧化應(yīng)激水平和膠原沉積增加[19]。在最近的一項研究中，給予Cxcr3基因敲除和C57BL/6野生型小鼠類似的HFHF飲食，Cxcr3基因敲除小鼠的肝臟組織學(xué)得到改善，壞死性炎癥水平降低，脂質(zhì)過氧化減少，表明Cxcr3在HFHF小鼠模型NASH形成中起著關(guān)鍵作用[20]；4)蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(methionine choline deficiency ，MCD)模型。食物中缺乏蛋氨酸及膽堿酸會影響到肝臟的β氧化和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein ，VLDL)的轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致肝內(nèi)脂質(zhì)積聚。在一項研究中[21]，實驗人員給予不同品系的大鼠MCD 飲食喂養(yǎng)4周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wistar雄性大鼠脂肪變性最嚴(yán)重。雄性C57/BL6小鼠的炎癥和壞死最為嚴(yán)重，脂質(zhì)過氧化和超微結(jié)構(gòu)損傷，并最接近NASH的組織學(xué)特征。MCD模型的肝損傷發(fā)生迅速，但恢復(fù)正常飲食后是可逆的。然而，該模型的代謝特征與患者相反：胰島素、瘦素和葡萄糖水平降低。為解決上述問題，有學(xué)者聯(lián)合應(yīng)用膽堿不足(CD)、HFD構(gòu)建NAFLD相關(guān)動物模型，該飲食為20%蛋白質(zhì)，35%碳水化合物和45%脂肪，不添加膽堿。實驗動物在6～12周發(fā)生NASH，12個月時，可誘導(dǎo)出NAFLD相關(guān)HCC[22]。

2 肝脂肪變性細(xì)胞模型

2.1 FFA誘導(dǎo)的細(xì)胞模型 人HepG2肝癌細(xì)胞株與肝細(xì)胞生物學(xué)功能相似，但能更好地耐受脂毒性，常用于研究肝細(xì)胞脂肪變。游離脂肪酸(free fatty acid ，F(xiàn)FA)可以合成TG，TG含量過高會引起肝脂肪變性。因此，F(xiàn)FA常用于誘導(dǎo)建立脂肪變性細(xì)胞模型。Zhang et al[23]采用25%胎牛血清和0.1%中/長鏈脂肪乳作用一段時間后，續(xù)貫用0.1 mmol/L FFA作誘導(dǎo)液繼續(xù)作用細(xì)胞，成功建立了脂肪變性模型。實驗室常用的細(xì)胞模型主要缺點是不能支持長時間培養(yǎng)、細(xì)胞易失去正常形態(tài)、脫離體內(nèi)環(huán)境(如枯否細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等)的影響，并不能很好地反映肝細(xì)胞的表型和功能。Kozyra et al[24]用人原代肝細(xì)胞構(gòu)建的3D球面細(xì)胞模型克服了這些缺點。該模型不僅維持了細(xì)胞形態(tài),而且保存了肝細(xì)胞在病理狀態(tài)下的胰島素抵抗。

2.2 果糖誘導(dǎo)的細(xì)胞模型 研究發(fā)現(xiàn)，果糖水飼養(yǎng)C57BL/6小鼠8周即出現(xiàn)明顯的肝臟脂肪變，提示人類NAFLD的普及與甜味劑的大量使用及含糖飲料的攝入相關(guān)[25]。選擇人正常肝細(xì)胞系LO2細(xì)胞，以不同濃度的果糖處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞脂肪變性，并與FFA干預(yù)相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 mmol/L果糖作用于LO2細(xì)胞24 h后，即可上調(diào)肝細(xì)胞脂肪合成基因，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變。果糖誘導(dǎo)模型和經(jīng)典的FFA誘導(dǎo)模型結(jié)果顯示，果糖可以顯著增加LO2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白的表達(dá)，說明果糖可能主要影響脂質(zhì)合成源頭，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積[26]。Kozyra用果糖作用3D模型時也岀現(xiàn)了脂肪變性，并呈時間依賴關(guān)系。當(dāng)撤去脂肪變性培養(yǎng)液或加入治療性藥物后，脂肪變性緩解[24]。

2.3 基于細(xì)胞外基質(zhì)支架構(gòu)建3D肝臟NAFLD模型 肝細(xì)胞在2D環(huán)境中培養(yǎng)一段時間，其增殖能力和部分生物學(xué)功能喪失， 而在3D環(huán)境中培養(yǎng)時，肝細(xì)胞的增殖能力和生物學(xué)功能與2D環(huán)境相比大大提升[27]。因此，許多研究者探索應(yīng)用生物材料構(gòu)建細(xì)胞培養(yǎng)的三維微環(huán)境。Yamada et al[28]構(gòu)建了一種由3T3細(xì)胞-肝細(xì)胞-3T3 細(xì)胞構(gòu)成的三明治樣類肝索結(jié)構(gòu)的凝膠纖維模型，該模型的肝細(xì)胞與傳統(tǒng)的平面培養(yǎng)相比，肝細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)增多，白蛋白和尿素合成能力增強。Rennert et al[29]在此基礎(chǔ)上，嘗試將更多種類的細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、HepaRG 細(xì)胞、星狀細(xì)胞)植入“三明治”模型共培養(yǎng)，以期更接近正常的肝索結(jié)構(gòu)。近年來，3D打印技術(shù)也應(yīng)用于三維支架的構(gòu)建，將誘導(dǎo)體系與細(xì)胞混合噴涂，疊加其他種類細(xì)胞、生長因子、信號分子等，在計算機(jī)指令下打印，形成有生理功能的活體器官。

蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，肝臟微環(huán)境的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白種類繁多[30]，因此事實上肝臟來自細(xì)胞外基質(zhì)的信號遠(yuǎn)比2D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)成分復(fù)雜得多。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、肝臟組織工程技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一些新的方法制備人工肝臟。肝臟組織工程的核心首先是通過肝臟脫細(xì)胞獲得理想的支架材料，支架保留了細(xì)胞外基質(zhì)，去除了細(xì)胞、遺傳物質(zhì)，降低了免疫原性。組織工程的另一核心是生物支架的再細(xì)胞化，灌注的細(xì)胞可為肝細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，這樣即可獲得具有功能的組織工程肝臟。Uygun et al[31]在2010年成功將肝細(xì)胞種植到脫細(xì)胞肝臟支架上，并檢測再細(xì)胞化后肝臟白蛋白的分泌、尿素合成等功能。Wu[32]將人肝細(xì)胞株HepG2種植到肝基質(zhì)支架，灌流完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞形成功能性肝組織。隨后,用高脂培養(yǎng)基灌注該組織，建立了與NAFLD肝臟相似的組織工程脂肪肝(tissue engineering fatty liver，TEF)模型。培養(yǎng)8天后發(fā)現(xiàn)TEF脂肪積累比對照組多2倍，脂肪酸代謝受損，與NAFLD相關(guān)的PDK4、CYP2E1、CYP7A1基因均上調(diào)，CYP3A4代謝活性明顯受損。TEF肝隨后用二甲雙胍處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NAFLD患者使用二甲雙胍有相似的效果。由此可見，TEF肝臟為研究NAFLD的發(fā)展過程和藥物效應(yīng)提供了一個穩(wěn)定和可重復(fù)的模型。但是,這一模型缺乏肝臟非實質(zhì)細(xì)胞與肝細(xì)胞相互作用，細(xì)胞外基質(zhì)中缺乏許多重要的影響因子。

3 小結(jié)

NAFLD理想的模型應(yīng)有脂肪增多、體質(zhì)量增加、胰島素抵抗、血脂異常并全譜表達(dá)NAFLD組織學(xué)，還應(yīng)與纖維化進(jìn)展有關(guān)。然而，在各種模型中，誘導(dǎo)脂肪變性相對容易，但完全轉(zhuǎn)化為人類NAFLD-NASH-肝纖維化-HCC的疾病過程仍然是一個挑戰(zhàn)。

2D體外脂肪變性細(xì)胞模型因其實驗周期短、重復(fù)性好、實驗條件易于控制。HFD模型可以反映人NAFLD的疾病演變過程,且造模停止后病變也不會很快好轉(zhuǎn)，為試驗中藥物干預(yù)提供窗口。但該模型造模時間較長，目前要解決時間成本問題，高脂飼料配方的尚有改良的余地。研究顯示飼料中脂肪含量越高，小鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量越高，肝臟脂肪變性程度越高[33]。對于遺傳學(xué)模型如瘦素及瘦素信號通路缺陷模型，這種突變在肥胖人群中并不普遍，與遺傳問題相關(guān)的脂肪變性病例也并不常見[34]。此外，由于代謝背景的不同，遺傳模型顯示出不同的肝細(xì)胞損傷[35]。目前，尚沒有一種模型能在完美復(fù)制人類疾病和時間成本上實現(xiàn)雙贏，但組織工程肝臟模型或許可以將這一目標(biāo)變?yōu)榭赡埽核谝欢ǔ潭壬辖Y(jié)合了2D模型和傳統(tǒng)動物模型的優(yōu)勢，目前我們需要克服的障礙是解決在單純性脂肪變性的基礎(chǔ)上脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物在肝細(xì)胞中積聚并伴隨炎性細(xì)胞浸潤和/或膠原沉積(如纖維化)而引起的細(xì)胞損傷。這種反應(yīng)是NAFLD進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化的必由之路。因此，我們需要利用不同的實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)來改善我們的模型，模擬NAFLD患者肝臟中實際存在的細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-因子相互作用，從而創(chuàng)造更精確的組織三維模型。

通過不斷開創(chuàng)新的造模方法，使動物模型、細(xì)胞模型能更加符合人類NAFLD的疾病的特點，更加迎合研究者的意圖，提高模型的重復(fù)性及穩(wěn)定性，為人類早日認(rèn)識NAFLD的發(fā)生機(jī)制及獲得臨床干預(yù)提供可能。