劉金長(zhǎng)，張海清，王輝，胡成全，徐蕾

（江西省贛州市贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，江西 贛州 341000）

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展和生活方式的改變，眼科疾病越來越多，尤其是視網(wǎng)膜缺血之后再灌注造成的損傷病癥。該病是指在一定程度缺血后，發(fā)生的視網(wǎng)膜功能及結(jié)構(gòu)變化，一般是在為視網(wǎng)膜血流實(shí)施再灌注時(shí)導(dǎo)致的損傷。核桃油具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，除含有多種維生素還有更多的微量元素[1-2]。將核桃油應(yīng)用于治療視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中具有一定的科學(xué)依據(jù)。但相關(guān)研究只是在提取方法和成分分析及分離方面，關(guān)于視網(wǎng)膜神經(jīng)的營(yíng)養(yǎng)研究較少[3-4]。因此，本研究主要分析核桃油在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡中產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取Sprague Dawley成年大鼠90只，雄性，體質(zhì)量200～300 g，隨機(jī)分為正常組、視網(wǎng)膜缺血實(shí)施再灌注組（RIR）及核桃油組，每組30只。正常組大鼠給予常規(guī)治療，無(wú)任何手術(shù)操作，其他兩組大鼠實(shí)施前房穿刺，在缺血1 h后再次灌注，其中，RIR組大鼠不給予干預(yù)，核桃油組成功造模后喂養(yǎng)核桃油7 d。3組大鼠均選擇左眼對(duì)照。大鼠眼部和角膜透明度進(jìn)行裂隙燈檢，所有大鼠的晶體均無(wú)任何渾濁，均未發(fā)生眼底病變問題。

實(shí)驗(yàn)試劑及水合氯醛購(gòu)自天根生化科技企業(yè)，NGF、酒精、甲醛溶液及PBS購(gòu)自北京市賽馳生物有限公司；SABC試劑盒和BAX及BCL-2等購(gòu)自武漢市博士德生物公司。本研究符合動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建RIRI模型 通過前房穿刺術(shù)升高大鼠的眼內(nèi)壓，并對(duì)視網(wǎng)膜的中央動(dòng)脈導(dǎo)致的視網(wǎng)膜缺血現(xiàn)象進(jìn)行阻斷，這是現(xiàn)階段應(yīng)用較多的一種RIRI模型建立的模型。首先進(jìn)行稱重，需10%的水合氯醛，通過300 mg/kg的劑量為大鼠進(jìn)行腹腔注射，麻醉起效后，取大鼠臥位，并固定其頭部，為右眼進(jìn)行造模，然后選擇0.3%的奧布卡因滴眼液為大鼠進(jìn)行局部的麻醉。將0.9%氯化鈉溶液和輸液器頭皮針順著顳側(cè)角鞏膜緣的位置向眼前房進(jìn)行刺入，防止損傷虹膜以及晶體。打開輸液器開關(guān)，升高輸液袋，與實(shí)驗(yàn)眼的垂直距離保持為150 cm，大鼠的眼內(nèi)壓達(dá)到110 mmHg，球結(jié)膜和虹膜及視網(wǎng)膜會(huì)迅速變蒼白，此時(shí)大鼠的視網(wǎng)膜中央的動(dòng)脈阻斷供血，選擇膠帶固定頭皮針。實(shí)施1 h高壓灌注，降低輸液袋，保持和眼球同水平，球結(jié)膜和虹膜顏色會(huì)快速恢復(fù)正常，同時(shí)，大鼠眼底的視網(wǎng)膜開始向橘紅色恢復(fù)，受阻的血流再次被開放，灌注形成。完成手術(shù)后運(yùn)用左氧氟沙星的滴眼液防止術(shù)后感染。正常組不實(shí)施手術(shù)，其余均實(shí)施前房穿刺術(shù)。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量 完成造模后，需在灌注后7 d，及時(shí)為大鼠摘除眼球，同時(shí)保留1 mm視神經(jīng)，通過酸性的福爾馬林液進(jìn)行固定，實(shí)施石蠟包埋和視網(wǎng)膜鋪片，選擇每組實(shí)施再次灌注7 d后的石蠟切片，給予免疫組化的染色計(jì)數(shù)。通過顯微鏡放大400倍，取3個(gè)視野觀察，并且計(jì)數(shù)。

1.2.3 測(cè)定氧化指標(biāo) 灌注7 d后為所有大鼠進(jìn)行麻醉，并收集血液，4℃離心選擇血清，通過黃嘌呤氧化酶方法測(cè)定的活性SOD對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“”表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 核桃油對(duì)RIRI視網(wǎng)膜SOD及MDA含量的影響 造模7 d后，缺血再灌注組的大鼠和正常組的大鼠比較，視網(wǎng)膜組織勻漿液SOD活性降低，MDA含量提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；核桃油喂養(yǎng)組大鼠和缺血再灌注組的大鼠比較，視網(wǎng)膜組織的勻漿液SOD活性明顯升高，MDA含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 核桃油對(duì)RIRI視網(wǎng)膜組織SOD及MDA含量的影響（±s）

表1 核桃油對(duì)RIRI視網(wǎng)膜組織SOD及MDA含量的影響（±s）

注：SOD，超氧化物歧化酶；MDA，丙二醛

指標(biāo)SOD（U/mg）MDA（nmol/mg）正常組89.12±9.72 0.84±0.14缺血再灌注組43.27±10.32 1.78±0.35核桃油喂養(yǎng)組69.72±8.23 1.34±0.32

2.2 RIRI后的BAX和BCL-2蛋白表達(dá)比較 對(duì)于BAX蛋白性的表達(dá)，一般是黃色及棕黃色的染色，存在于細(xì)胞漿中。BCL-2的蛋白陽(yáng)性是黃色及棕黃色，一般是存在于細(xì)胞漿中，正常組大鼠中無(wú)明顯的表達(dá)，經(jīng)過7 d后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BCL-2蛋白呈陽(yáng)性，見表2。

表2 RIRI后BAX和BCL-2蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 RIRI后BAX和BCL-2蛋白表達(dá)比較（±s）

指標(biāo)BAX BCL-2正常組0.268±0.013 0.316±0.019缺血再灌注組0.431±0.019 0.312±0.002核桃油喂養(yǎng)組0.281±0.003 0.456±0.013

3 討論

正常生理情況下，大鼠細(xì)胞經(jīng)過氧化后形成活性氧水平波動(dòng)會(huì)在具體的范圍中，細(xì)胞內(nèi)抗氧化的防御體系發(fā)生很大的改變，繼而使各個(gè)水平均實(shí)現(xiàn)氧化以及抗氧化的平衡。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組SOD活性降低，MDA升高，視網(wǎng)膜缺血實(shí)施再次灌注時(shí)，該組大鼠的機(jī)體組織中的抗氧化酶活性得到降低，同時(shí)，脂質(zhì)過氧化加重了損傷的程度。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠的SOD活性明顯升高，MDA降低，說明視網(wǎng)膜缺血實(shí)施再次灌注損傷期間核桃油發(fā)揮保護(hù)性效果[5-6]。

本研究結(jié)果顯示，RIRI中凋亡的效果，BCL-2蛋白以及BAX蛋白表達(dá)受再灌注時(shí)間的影響，在6 h時(shí)RGC已明顯凋亡，長(zhǎng)時(shí)間后，BCL-2蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時(shí)BAX表達(dá)增強(qiáng)，24 h開始達(dá)到高峰，48 h開始下降，但仍維持較高水平，至3 d減少。此時(shí)促凋亡的因素比較明顯，導(dǎo)致RGC受損程度逐漸加重，最終死亡。因此，可推測(cè)出，核桃油的應(yīng)用會(huì)對(duì)BCL-2蛋白表達(dá)和BAX蛋白表達(dá)產(chǎn)生抑制效果，繼而對(duì)RIRI中視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制[7-8]。