席曉宇 李冰 鄭少杰 鐘長青 李連勇

戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學中心消化內(nèi)科，北京 100101

【提要】 類器官是應(yīng)用體外3D培養(yǎng)技術(shù)建立的結(jié)構(gòu)和功能上類似于器官的小型組織，具有組織自我更新及可長期培養(yǎng)的特點。近年來，腫瘤類器官模型作為一種新的模型，在腫瘤發(fā)生機制、藥物篩選、精準醫(yī)療、器官移植等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。本文重點討論類器官在胰腺癌研究中的構(gòu)建及應(yīng)用研究進展。

目前，胰腺癌研究領(lǐng)域中常用的模型是腫瘤細胞系(patient-derived cancer cell lines，PDC)和人源腫瘤異種移植模型(patient-derived tumor xenograft，PDX)。PDC培養(yǎng)條件簡單，體外可無限增殖，但其無法模擬腫瘤體內(nèi)生長環(huán)境，不能代表腫瘤本身的異質(zhì)性，缺少空間組織性和多種細胞類型等[1]。PDX能夠在一定程度上模擬體內(nèi)微環(huán)境，也能較大程度保留腫瘤異質(zhì)性，但存在實驗周期長、移植成功率低、成本高等局限性，這在很大程度上限制了臨床研究的進展[2]。近年來，體外3D腫瘤細胞培養(yǎng)模型，尤其是類器官模型受到了研究者的廣泛關(guān)注。與PDC和PDX相比，腫瘤類器官可以更近似地模擬來源組織的結(jié)構(gòu)、功能及生長環(huán)境，具有培養(yǎng)成功率高、培養(yǎng)周期短、保真性高等優(yōu)點。因此，類器官技術(shù)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制研究、藥物篩選、個體化治療研究、器官移植等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，已成為消化系統(tǒng)腫瘤研究的熱點。本文就類器官在胰腺癌研究中的構(gòu)建及應(yīng)用做一綜述。

一、類器官的概念

類器官是利用干細胞的自我更新及分化能力，在體外培養(yǎng)形成的一種在細胞成分、組織架構(gòu)及特定功能等方面與相應(yīng)器官高度相似的小型組織，實現(xiàn)了在體外培養(yǎng)環(huán)境中對特定器官的復(fù)制[3]。由于類器官具有可大規(guī)模培養(yǎng)、培養(yǎng)時間較短、保真性高等特點，故成為腫瘤研究和治療的可靠模型。近年來已有多種腫瘤類器官成功構(gòu)建，并應(yīng)用于腫瘤基因組學及抗腫瘤藥物篩選等，特別是為個性化癌癥治療開辟了新的視野。

二、胰腺癌類器官的構(gòu)建

腫瘤類器官是保留原發(fā)腫瘤組織學和遺傳學特征的原發(fā)腫瘤細胞三維培養(yǎng)物，其培養(yǎng)需要初始條件(包括起始細胞類型)、物理條件(基質(zhì)膠)、生長因子及信號傳導。胰腺癌類器官構(gòu)建一般來源于外科手術(shù)切除的腫瘤標本或活檢組織，比如細針穿刺。在一項大規(guī)模的隊列研究中分離和傳代的胰腺癌類器官模型在切除腫瘤標本及細針活檢之間具有相當?shù)南嗨菩?>70%)，這使得在胰腺癌的各個階段都能產(chǎn)生類器官模型[4]。活檢組織經(jīng)過酶處理后，可嵌入基質(zhì)內(nèi)或在氣液界面培養(yǎng)。胰腺癌類器官構(gòu)建需要添加EGF(分裂素)、R-spondin-1(增信號)、 Noggin(抑制BMP信號)和Wnt3a等，另外還需煙酰胺、FGF10(絲裂原)、A83-01(Alk抑制劑)、前列腺素E(PGE、絲裂原)，進行長期擴增[5]。初始培養(yǎng)條件根據(jù)原始組織中起始細胞的類型選取不同的培養(yǎng)基，胰腺癌類器官的基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般為Advanced DMEM/F-12培養(yǎng)基。在最佳生長狀態(tài)下，胰腺癌類器官可在20～45 d左右形成。胰腺癌類器官的構(gòu)建方法目前隨著研究不斷改進，構(gòu)建成功率與培養(yǎng)速度也逐漸提高。

三、胰腺癌類器官的應(yīng)用與研究

1．在胰腺癌發(fā)生發(fā)展機制中的研究：腫瘤從發(fā)生、發(fā)展到惡化、轉(zhuǎn)移及藥物抵抗是一個復(fù)雜的多環(huán)節(jié)相互聯(lián)系的過程。而利用類器官技術(shù)建立不同演變階段的腫瘤模型，可以為腫瘤各階段機制的研究工作提供可用的優(yōu)質(zhì)平臺。研究表明胰腺癌的發(fā)生與多種基因改變有關(guān)，如致癌基因(K-ras等)的激活和抑癌基因(TP53、p16/CDKN2A、SMAD4、BRCA2等)的失活。目前已知有MAPK、Wnt、Notch、Hedgehog、PI3K/AKT等信號通路參與。胰腺癌進展過程中也存在大量基因改變，如K-ras、TP53基因突變造成Wnt、MAPK、Notch信號持續(xù)激活，易導致腫瘤發(fā)生。2015年，Boj等[6]率先報道了小鼠和人胰腺癌的3D類器官模型，可以移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生類似胰腺上皮內(nèi)瘤變的侵襲前病變，進而表現(xiàn)出侵襲性腺癌并轉(zhuǎn)移的特異性。Moreira等[7]采用RNAseq和質(zhì)譜分析對小鼠胰腺三維器官進行了基因表達和蛋白組學分析，觀察到基因和蛋白組學特征與胰腺腫瘤的進展有關(guān)。Bailey等[8]結(jié)合了來自456個胰腺癌全基因組、外顯子和RNA測序分析定義了4種不同的胰腺導管腺癌亞型(鱗癌、胰腺祖細胞腫瘤、免疫原性亞型和異常分化的內(nèi)外分泌腫瘤)，并將每種亞型與特定的分子通路、組織病理學特征和生存率聯(lián)系起來，其結(jié)果有助于發(fā)現(xiàn)潛在的靶向治療方法。以上研究均顯示，胰腺癌類器官為胰腺癌發(fā)生機制和特定基因功能的研究提供了一個全新的平臺。

2．在抗腫瘤藥物篩選中的應(yīng)用：近年來，包括免疫治療藥物在內(nèi)的靶向藥物改善了患者的預(yù)后，但部分患者仍無法從現(xiàn)有治療中獲益。由于腫瘤異質(zhì)性的存在，患者個體差異和藥效之間存在密切關(guān)系，甚至同一腫瘤中不同癌細胞對藥物的反應(yīng)也有顯著差異。胰腺癌通常發(fā)現(xiàn)較晚，只有10%～15%的患者可行手術(shù)治療，而對無法手術(shù)切除的胰腺癌患者，類器官為抗腫瘤藥物精準篩選提供了可靠的選擇，從胰腺癌患者的腫瘤組織中提取并構(gòu)建的類器官用于高通量藥物篩選，更有助于篩選有效藥物[9]。Tiriac等[10]利用156例患者來源的類器官，建立了一個平臺來測試單藥化療和靶向藥物治療，結(jié)果顯示胰腺癌類器官的治療效果與患者的結(jié)果相一致。Huang等[11]研發(fā)出了一種利用三維細胞培養(yǎng)技術(shù)從胰腺癌患者組織中擴增和培養(yǎng)原代癌細胞類器官，并進行了藥物檢測。研究者使用吉西他濱和表觀遺傳抑制劑處理5例患者的腫瘤類器官，結(jié)果顯示5個樣本對藥物有不同的敏感度，且敏感度與耐藥生物標志物呈正相關(guān)，胰腺癌類器官能夠在體外保留患者組織本身對新型藥劑的敏感性。盡管這是一個小樣本測試，但它證明了使用類器官技術(shù)研究測試腫瘤異質(zhì)性的可行性，此技術(shù)有望建立多個患者腫瘤組織的活體樣本庫用于研究個體患者的特異致病機制，有助于針對性研究和個體化的藥物測試[12]。

3．在胰腺癌個體化治療中的研究：個體化治療是腫瘤治療的趨勢，而胰腺癌類器官模型可用來進行有針對性的研究和篩選靶向藥物[13-14]。研究表明，腫瘤反應(yīng)、進展與器官樣體對特定治療方案的敏感性、耐藥性之間有良好的相關(guān)性，這表明器官樣體系統(tǒng)可預(yù)測治療結(jié)果[15]。隨著胰腺癌生物活體組織庫的建立，研究者使用腫瘤和鄰近正常的器官進行了深入的基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，從而對腫瘤特異性的DNA和RNA變異進行比較和識別，利用自動化定量高通量篩選系統(tǒng)，可以更好地發(fā)現(xiàn)和驗證新型藥物，模擬和研究靶向藥物[16]。在臨床腫瘤治療中，可以單一或組合藥物進行敏感性篩選，然后在個體胰腺癌類器官模型中進行驗證，確定每個患者的藥物治療有效方案，進而實現(xiàn)個體化治療。目前使用胰腺癌類器官進行個體化治療的研究有限，但在這些初步研究結(jié)果的支持下，相信未來胰腺類器官可進一步推進胰腺癌的個體化治療。

四、胰腺癌類器官的局限性

類器官具有顯著優(yōu)勢，但仍存在一定局限性。首先類器官通常保留多個類型細胞，模型中缺乏神經(jīng)、血管及免疫細胞，限制了類器官在篩選靶向藥物的應(yīng)用。其次，類器官構(gòu)建中需要使用基質(zhì)膠，而基質(zhì)膠的復(fù)雜性和組分的可變性使得培養(yǎng)環(huán)境難以完全統(tǒng)一，且基質(zhì)膠的應(yīng)用會影響藥物的滲透。此外，在類器官培養(yǎng)過程中需要添加生長因子及化學試劑，這可能會造成細胞基因突變或生長發(fā)育異常，從而影響藥物試驗結(jié)果。

五、小結(jié)與展望

胰腺癌類器官是當前研究的熱點課題，相關(guān)研究領(lǐng)域正在蓬勃發(fā)展。在藥物敏感性篩選方面，胰腺癌類器官具有高通量、高特異性的特點，可大幅度縮短臨床前試驗與臨床試驗的周期、降低開發(fā)成本與風險，為精準藥物治療提速。在發(fā)病機制和治療方面，胰腺癌類器官具有高保真性，可以深入研究疾病的發(fā)生發(fā)展機制。此外將基因編輯技術(shù)引入胰腺癌類器官模型中，可以更加靈活和準確地在基因?qū)用娌僮饕认侔╊惼鞴?，使精準醫(yī)學研究成為可能。但該技術(shù)目前尚不成熟，有許多問題需進一步探究，如人體中的免疫成分、血管成分和神經(jīng)成分無法在目前的類器官系統(tǒng)中很好地體現(xiàn)；腫瘤類器官的培養(yǎng)環(huán)境仍與腫瘤在人體生長的微環(huán)境有一定差距；培養(yǎng)基基質(zhì)及培養(yǎng)基中的成分需進一步標準化；培養(yǎng)體系有待進一步優(yōu)化；利用胰腺癌類器官所進行的體外藥敏試驗仍需進一步與臨床結(jié)合等。相信隨著類器官技術(shù)的發(fā)展，胰腺類器官技術(shù)在疾病模型、藥物開發(fā)及個體化治療領(lǐng)域?qū)⑷〉瞄L足進展。

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