崔芳 彭立嗣 金震東

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，上海市胰腺疾病研究所，上海 200433

胰腺癌是惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤之一，雖然近年來預(yù)后稍有改善，但5年生存率仍不足9%[1]。胰腺癌早期診斷困難，大多數(shù)診斷明確時(shí)已屬中晚期。胰腺癌的具體發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，從基因?qū)用嫜芯坑兄谶M(jìn)一步了解其瘤內(nèi)異質(zhì)性及惡性進(jìn)展，從而對(duì)胰腺癌的早期診斷、分期及尋找新的藥物治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)到單個(gè)細(xì)胞的基因變化，便于進(jìn)一步加深對(duì)胰腺癌組織內(nèi)不同細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)。

一、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的研究進(jìn)展

2009年Tang等[2]首次報(bào)道了基于高通量測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，近10多年來相關(guān)技術(shù)得到飛速發(fā)展。2011年Navin等[3]開發(fā)了單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)，2013年湯富酬課題組[4]實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞全基因組甲基化測(cè)序。2015年Drop-seq[5]和inDrop技術(shù)[6]相繼推出，通過微流控技術(shù)結(jié)合升級(jí)液滴和條形微珠，微珠直接捕獲mRNA，極大提高了測(cè)序細(xì)胞通量，降低了成本。2017年Zheng等[7]提出10×GemCode技術(shù)，該技術(shù)將條碼反應(yīng)液滴以油滴封裝，反轉(zhuǎn)錄效率更高，且樣本量可提高至10萬個(gè)。目前常用的10×Genomics Chromium系統(tǒng)便是基于該技術(shù)。

在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方面，近年來又涌現(xiàn)出數(shù)種單細(xì)胞RNA-seq的cDNA擴(kuò)增方法，包括PCR擴(kuò)增(Tang/Brady[2,8]方法、Smart-seq[9]、Smart-seq2[10]、STRT-seq[11]和SMA[12])、體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(qCell expression by linear amplification and sequencing，CEL-seq)[13]和Phi29聚合酶擴(kuò)增(Phi29-mRNA amplification，PMA)[14]3類。以Smart-seq為例，Smart-seq技術(shù)設(shè)計(jì)了兩個(gè)特殊引物，引物1用于定位至mRNA的3′端，保證了逆轉(zhuǎn)錄酶的起始位置，結(jié)合MMLV(moloney murine leukemia virus)逆轉(zhuǎn)錄酶，可以在新合成的cDNA的3′末端多出幾個(gè)C堿基，引物2可以與其發(fā)生雜交，引導(dǎo)MMLV酶以cDNA第一鏈為模板發(fā)揮DNA聚合酶作用，從而獲得全長(zhǎng)雙鏈cDNA。2014年該方法優(yōu)化后研發(fā)出了具有更高靈敏度、準(zhǔn)確度和覆蓋度的Smart-seq2技術(shù)。目前，以STRT-seq和Smart-seq2為代表的PCR擴(kuò)增方法已經(jīng)成為最常用的單細(xì)胞cDNA文庫擴(kuò)增策略，廣泛應(yīng)用于商業(yè)化平臺(tái)及新型技術(shù)中。

目前，單細(xì)胞基因組測(cè)序技術(shù)由于捕獲效率問題落后于轉(zhuǎn)錄組學(xué)[14]。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增主要包括基于PCR技術(shù)的擴(kuò)增、基于MDA(multiple dilacement amplification)技術(shù)的擴(kuò)增，以及將MDA與PCR技術(shù)相結(jié)合后的多次退火環(huán)狀擴(kuò)增(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)技術(shù)。相比于前兩種擴(kuò)增技術(shù)，MALBAC可以降低擴(kuò)增偏倚性，提高測(cè)序覆蓋度，也可明顯提高單核苷酸多態(tài)性等位基因的檢出率，提高幅度為70%左右。Vitak等[15]報(bào)道了單細(xì)胞組合標(biāo)記測(cè)序技術(shù)(single-cell combinatorial indexed sequencing, SCI-seq)，即多次對(duì)細(xì)胞進(jìn)行條形碼編碼標(biāo)記后再測(cè)序，該方法提高了單細(xì)胞測(cè)序的規(guī)模，不僅可用于體細(xì)胞變異核酸檢測(cè)，還可用于PDAC Ⅲ 期分析，確定胰腺癌亞克隆特定的拷貝數(shù)變異。

2017年，加拿大BC癌癥研究中心發(fā)明了DLP(direct library preparation)方法[16]，即用微流控設(shè)備獲得單細(xì)胞并裂解，在微小體積(μl)內(nèi)直接加入標(biāo)簽序列并打斷基因組，隨后通過PCR加入索引條形碼和測(cè)序接頭，完成單細(xì)胞文庫的制備，減少基于預(yù)擴(kuò)增技術(shù)的偏差。2019年Laks等[17]對(duì)DLP技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，研發(fā)出了具有更高準(zhǔn)備度、可以構(gòu)建高質(zhì)量單細(xì)胞基因組文庫的DLP+技術(shù)，該技術(shù)不僅規(guī)避了擴(kuò)增帶來的弊端，提高了規(guī)?；?，而且保留了細(xì)胞及細(xì)胞核的圖像資料，同時(shí)展示了如何利用單細(xì)胞基因組測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定克隆群體及其基因組特征和單個(gè)細(xì)胞的特征(復(fù)制狀態(tài)和染色體錯(cuò)誤分離)以及基因組核形態(tài)學(xué)特征之間的關(guān)系，為研究單細(xì)胞的基因組提供了新的工具和資源庫。

隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展，在同一個(gè)單細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組，即單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)成為科學(xué)家關(guān)注焦點(diǎn)。2015年問世的DR-seq[18](DNA-mRNA sequencing)和G&t-seq[19](genomeand transcriptome sequencing)實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和基因組平行測(cè)序，DR-seq采取先逆轉(zhuǎn)錄、預(yù)擴(kuò)增，再將產(chǎn)物一分為二的策略；G&t-seq則是利用生物素化的多聚T引物將mRNA率先從基因組DNA中分離。兩種組學(xué)信息的整合不僅能揭示基因組變異對(duì)基因表達(dá)水平的影響，還可對(duì)細(xì)胞基因組譜系樹作進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組注釋。2016年scTrio-seq(single-cell triple omics sequencing technique)技術(shù)[20]實(shí)現(xiàn)了同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)變異(copy number variation, CVN)、DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，基于基因組CVN信息可以檢測(cè)癌細(xì)胞亞群，基于三元組學(xué)信息推斷亞群的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能，適于研究細(xì)胞群體在發(fā)育和癌癥中的異質(zhì)性。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的不斷更新和發(fā)展，其應(yīng)用將會(huì)在解析細(xì)胞異質(zhì)性、揭示微環(huán)境中細(xì)胞群體間的關(guān)系、追蹤疾病發(fā)生發(fā)展等研究中發(fā)揮更加重要的作用。

二、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在胰腺癌異質(zhì)性研究中的應(yīng)用

在胰腺癌的臨床實(shí)踐中，大量分型、分級(jí)和分期相同的胰腺癌患者治療效果和預(yù)后顯著不同，這表明不同胰腺癌患者之間存在異質(zhì)性。胰腺癌中PDAC占比達(dá)90%，為闡明PDAC之間的分子異質(zhì)性，Zhao等[21]收集了1 200例PDAC患者整個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過回顧性Meta分析，將PDAC劃分為6種分子亞型，每種亞型都具有其特征的基因表達(dá)譜，表現(xiàn)出不同臨床特點(diǎn)，進(jìn)而更好地分層PDAC患者，提供個(gè)性化治療。

此外，同一個(gè)體胰腺癌的癌細(xì)胞、腫瘤相關(guān)細(xì)胞之間也存在異質(zhì)性。Peng等[22]對(duì)24例原發(fā)性PDAC和11例正常胰腺對(duì)照進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，繪制了PDAC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，對(duì)胰腺癌導(dǎo)管上皮細(xì)胞分型，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)癌細(xì)胞惡性行為相關(guān)的亞群的增殖，往往伴隨著活化性T細(xì)胞的缺失，預(yù)示著較差預(yù)后。通過PDAC進(jìn)展的擬時(shí)序分析， 觀察到2 299個(gè)基因存在動(dòng)態(tài)變化，ERBB和Notch信號(hào)等通路中發(fā)生的多個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄因子被激活并參與到PDAC的腫瘤形成過程，為揭示PDAC的瘤內(nèi)異質(zhì)性機(jī)制及疾病進(jìn)展提供寶貴資源。

胰腺癌重要病理特征為間質(zhì)纖維組織顯著增生，即大量腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)浸潤(rùn)。Ligorio等[23]通過使用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)和RNA原位雜交技術(shù)，對(duì)不同比例CAFs與PDAC細(xì)胞混合培養(yǎng)后得到的92個(gè)PDAC細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)大量CAFs浸潤(rùn)誘導(dǎo)PDAC細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)或者增殖特性(proliferative, PRO)轉(zhuǎn)變，從而具有更強(qiáng)的侵襲能力。對(duì)195個(gè)PDAC患者原位腫瘤組織的腫瘤芯片行ki67(標(biāo)記EMT)和FN1(標(biāo)記PRO)的RNA原位雜交(in situ hybridization, ISH)，分析了319 626個(gè)單細(xì)胞，將腫瘤腺體內(nèi)含有的不同單細(xì)胞的種類和數(shù)量分為8類，其中高PRO以及高PRO和EMT細(xì)胞類型的患者生存期較短，從而清晰闡述了胰腺癌腫瘤內(nèi)部結(jié)構(gòu)，為揭示和研究胰腺癌異質(zhì)性提供證據(jù)。

胰腺癌在不同患者、同一個(gè)患者不同癌細(xì)胞之間存在明顯的異質(zhì)性。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以揭示組織內(nèi)不同細(xì)胞，同一細(xì)胞不同階段的異質(zhì)性。然而，由于PDAC的浸潤(rùn)特性，間質(zhì)占腫瘤腫塊的70%以上[24]，常嵌入正常胰腺組織，癌細(xì)胞占比小，且存在被蛋白酶降解的可能，胰腺癌樣本對(duì)單細(xì)胞測(cè)序提出了挑戰(zhàn)。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，可解決特殊小樣本的研究、異質(zhì)性亞群的分析、基因的功能富集、查找特異性標(biāo)志基因，為胰腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的深入研究提供有力技術(shù)支持。

三、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在胰腺癌侵襲機(jī)制研究中的應(yīng)用

胰腺癌的早期診斷困難，針對(duì)胰腺癌前病變進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序研究，可以識(shí)別早期胰腺癌病變的潛在標(biāo)志物。安德森癌癥中心分別選取來自2個(gè)低級(jí)別導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN)(LGD-IPMN)、2個(gè)高級(jí)別IPMN(HGD-IPMN)和2個(gè)PDAC(均通過手術(shù)切除)的5 403個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序，揭示了從非侵襲性IPMN發(fā)展為侵襲性癌癥的過程中，上皮及腫瘤微環(huán)境發(fā)生的異質(zhì)性改變。研究表明，即使在低級(jí)別的IPMNs中，也存在罕見細(xì)胞亞群具有侵襲性腫瘤轉(zhuǎn)錄特征的[25]。這種低頻細(xì)胞在LGD-IPMN中的表達(dá)譜可能在RNA測(cè)序過程中被忽略，進(jìn)一步說明了單細(xì)胞測(cè)序方法在闡明胰腺癌前體的上皮細(xì)胞及微環(huán)境異質(zhì)性是腫瘤進(jìn)展早期事件中的優(yōu)越性。

胰腺癌的高轉(zhuǎn)移特征是導(dǎo)致其預(yù)后差的重要原因[26]，約80%的胰腺癌患者伴有肝轉(zhuǎn)移，胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)也存在明顯的異質(zhì)性。Law等[27]對(duì)56例胰腺癌肝轉(zhuǎn)移患者組織標(biāo)本進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，根據(jù)其特點(diǎn)將胰腺癌分為4種亞型：代謝型、祖細(xì)胞類似型、增殖型和炎癥型。其中代謝型和祖細(xì)胞類似型患者采用FOLFIRINOX化療方案預(yù)后明顯好于吉西他濱化療組，而在增殖型和炎癥型患者中并無明顯差異，這一結(jié)果為確立胰腺癌肝轉(zhuǎn)移患者精準(zhǔn)治療策略奠定基礎(chǔ)?；趩渭?xì)胞蛋白組學(xué)水平的研究，可以對(duì)胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行研究，檢測(cè)表達(dá)稀有的蛋白組和轉(zhuǎn)錄物水平，進(jìn)一步映射胰腺癌中不同細(xì)胞亞群的類型和功能，對(duì)胰腺癌發(fā)生發(fā)展有更深層的認(rèn)識(shí)。

在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上，加拿大安省癌癥研究所[28]從314例Ⅳ期胰腺癌患者取樣，使用激光捕捉纖維切割技術(shù)純化腫瘤樣本，得到330份全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)和248份全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得分子證據(jù)，將胰腺癌重新定義為基底樣A型、基底樣B型、混合型、典型性A型和典型性B型5類。典型性A型和B型腫瘤通常發(fā)生在胰腺癌早期；基底樣A型腫瘤表現(xiàn)出化療抗性和更高的致死率，在胰腺癌晚期的占比更高；基底樣B型和混合型通常表現(xiàn)為可切除的原位腫瘤。此外，該研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)同一個(gè)腫瘤中基底樣和典型胰腺癌細(xì)胞共同存在，兩者比例呈負(fù)相關(guān)；EMT過程與基底樣信號(hào)的表達(dá)呈正相關(guān)。提示基底樣信號(hào)與胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的能力有關(guān)，證明新的分類的臨床意義，為評(píng)估胰腺癌預(yù)后奠定基礎(chǔ)。

四、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在胰腺癌化療耐藥研究中的應(yīng)用

化療是胰腺癌治療的主要手段之一，然而，耐藥是限制胰腺癌化療有效性的重要因素。CAFs在PDAC進(jìn)展及化療耐藥性中發(fā)揮重要作用。CAFs在PDAC中形成一層很厚的結(jié)締組織，阻礙了化療藥物進(jìn)入腫瘤。澳大利亞Garvan醫(yī)學(xué)研究所和Kinghorn癌癥中心的研究人員發(fā)現(xiàn)[29]，癌細(xì)胞可以分泌基底膜蛋白多糖，它是正?；|(zhì)的重要成分，在基底膜蛋白多糖的作用下，CAFs形成了既能保護(hù)癌細(xì)胞，又能協(xié)助癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的環(huán)境。此外，降低基底膜蛋白多糖可以顯著提高胰腺癌組織對(duì)化療的反應(yīng)性。Elyada等[30]采用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)人體和小鼠胰腺癌組織中腫瘤微環(huán)境成分進(jìn)行分析，證實(shí)肌纖維母細(xì)胞CAFs和炎性CAFs的存在，并定義了其獨(dú)特的基因特征。同時(shí)描述了一群表達(dá)MHCⅡ分子和CD74但不表達(dá)經(jīng)典共刺激分子的CAFs新群體，它們能以抗原特異性方式激活CD4+T細(xì)胞，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。這一研究為認(rèn)識(shí)PDAC中CAFs的異質(zhì)性，并開發(fā)專門針對(duì)腫瘤間質(zhì)中CAFs的靶向療法提供了新的理論基礎(chǔ)。

總之，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，但其在胰腺癌方面的應(yīng)用仍處于起步階段，許多問題需要繼續(xù)探索。例如如何應(yīng)用單細(xì)胞RNA測(cè)序評(píng)價(jià)胰腺癌一線化療藥物的治療效果，如何利用胰腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞行單細(xì)胞測(cè)序從而實(shí)現(xiàn)早期診斷、篩選敏感藥物并預(yù)測(cè)預(yù)后等。相信隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的不斷研發(fā)和改善，上述問題可獲得進(jìn)一步研究和探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突