代旭冉，黃義文，李 騰，鄧 云，蘇 研，買春艷，于立強，于廣軍，李輝利，劉宏偉，楊 麗，周 陽，張宏軍，李洪杰

(1.河北科技師范學(xué)院，農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，河北秦皇島 066004；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/作物分子育種工程實驗室，北京 100081；3.福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建建陽 354200；4.新鄉(xiāng)矮敗小麥育種技術(shù)創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng)453731；5.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院趙縣試驗基地，河北趙縣 051530)

赤霉病(Fusarium head blight,FHB)主要是由禾谷鐮孢菌[GibberellazeaeSchw.(Petch)]引起的一種嚴(yán)重影響禾谷類作物產(chǎn)量和品質(zhì)的毀滅性病害[1]。據(jù)統(tǒng)計，1993-2001年，赤霉病給美國小麥(TriticumaestivumL.)和大麥(HordeumvulgareL.)生產(chǎn)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)76.7億美元[2]。此外，赤霉病病菌產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)等毒素，食用被DON污染的籽粒后會嚴(yán)重危害人類和牲畜的健康[3-4]。赤霉病一直以來是限制我國南方麥區(qū)小麥生產(chǎn)的主要病害，尤其在長江中下游地區(qū)[5]。近年來由于耕作制度和氣候的變化，赤霉病已經(jīng)向北方麥區(qū)擴(kuò)展，目前已成為黃淮冬麥區(qū)的主要病害之一，如2012年僅河南省發(fā)病面積就超過339.69萬hm2[6]。因此，快速提高小麥品種的赤霉病抗性已經(jīng)成為黃淮冬麥區(qū)最重要的育種目標(biāo)之一。

赤霉病抗性是受多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀。在小麥中已經(jīng)定位到250多個與赤霉病抗性相關(guān)的QTL[7-8]。其中，F(xiàn)hb1被認(rèn)為是抗擴(kuò)展效應(yīng)最大、抗性最穩(wěn)定的位點，在不同定位群體中可解釋20%～50%的表型變異[7,9-10]。目前，F(xiàn)hb1的候選基因TaHRC已經(jīng)被克隆并已開發(fā)了功能標(biāo)記，這為利用該基因的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇提供了便利[11]。世界上很多國家利用Fhb1分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)開展小麥抗赤霉病育種，并取得了顯著進(jìn)展[12-15]。據(jù)報道，將Fhb1基因?qū)朊绹布t春小麥，已經(jīng)培育出一系列抗赤霉病品種并商業(yè)化推廣[16-17]。Xie等[12]將來自蘇麥3號的Fhb1導(dǎo)入到5個澳大利亞小麥品種，發(fā)現(xiàn)攜帶Fhb1的后代發(fā)病嚴(yán)重度降低了42%～53%。Randhawa等[13]通過把Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5基因?qū)爰幽么蟾胁∑贩N，成功培育出抗病品種Waskada、Carberry和Cardale，并已投入商業(yè)化生產(chǎn)。

Fhb1基因主要分布在東亞地區(qū)，特別是中國南方和日本[11]，推測我國長江中下游麥區(qū)小麥品種Fhb1感病等位基因發(fā)生突變是其抗病等位基因的起源[18]?？钩嗝共∮N一直是長江中下游麥區(qū)的主要育種目標(biāo)，這一麥區(qū)生產(chǎn)上大面積種植的品種對赤霉病均具有較好的抗性[19-20]。歷史上赤霉病在我國黃淮冬麥區(qū)發(fā)病很輕，很少引起育種家重視，導(dǎo)致目前該麥區(qū)生產(chǎn)上種植的絕大部分品種都高感赤霉病。由于生態(tài)類型的差異，南方麥區(qū)抗赤霉病的春性品種很難直接應(yīng)用于黃淮冬麥區(qū)，也很難通過單交的方式直接選育出適合該麥區(qū)種植的品種。黃淮冬麥區(qū)開展抗赤霉病育種的另一個困難是年際間赤霉病發(fā)病嚴(yán)重程度變化很大，在不發(fā)病或發(fā)病很輕的年份，很難進(jìn)行田間抗病性選擇。

目前黃淮冬麥區(qū)抗赤霉病育種在材料和技術(shù)方面缺乏必要的積累，因此，提高品種抗性由高感到中感水平是黃淮冬麥區(qū)抗赤霉病育種的重要一步。本課題組前期通過嘗試有限回交的方法，利用Fhb1功能標(biāo)記將來自長江中下游麥區(qū)抗赤霉病品種的Fhb1基因?qū)朦S淮冬麥區(qū)小麥品種周麥16中，發(fā)現(xiàn)回交一代的赤霉病抗性比周麥16顯著提高[21]。隨后，利用周麥16衍生系輪選136和輪選13進(jìn)行第二輪回交，發(fā)現(xiàn)輪選136遺傳背景下BC2F2群體赤霉病抗性水平明顯優(yōu)于輪選13背景[22]。在此基礎(chǔ)上，本研究對輪選136背景下6個BC2F3群體161個純合Fhb1-R株系進(jìn)行三個環(huán)境下的赤霉病抗性表型評價，進(jìn)而對入選的BC2F4品系進(jìn)一步評價，明確Fhb1在輪選136背景下對赤霉病抗性的影響，以期為黃淮冬麥區(qū)赤霉病抗性分子育種提供技術(shù)支撐和育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用周麥16矮敗小麥近等基因系(簡稱矮敗周麥16)分別與6個赤霉病抗性達(dá)到中抗以上水平且攜帶Fhb1基因的供體(蘇麥3號、寧麥9號、寧麥13、建陽84-1、建陽84-2和建陽798-2)雜交，獲得F1，F(xiàn)1與周麥16回交，然后將攜帶Fhb1基因的BC1F1植株與周麥16衍生系輪選136進(jìn)行第二次回交，獲得6個BC2F1群體，然后自交產(chǎn)生6個BC2F2回交群體，即群體1(矮敗周麥16/蘇麥3號//周麥16/3/輪選136)、群體2(矮敗周麥16/寧麥9號//周麥16/3/輪選136)、群體3(矮敗周麥16/寧麥13//周麥16/3/輪選136)、群體4(矮敗周麥16/建陽84-1//周麥16/3/輪選136)、群體5(矮敗周麥16/建陽84-2/周麥16/3/輪選136)和群體6(矮敗周麥16/建陽798-2//周麥16/3/輪選136)。在BC2F3群體中，通過對Fhb1不同等位基因檢測，將攜帶純合Fhb1抗性等位基因(Fhb1-R)的BC2F3株系在三個環(huán)境(2019年福建南平、河南新鄉(xiāng)和北京)下進(jìn)行赤霉病抗性評價。2020年將入選的BC2F4品系繼續(xù)在河南新鄉(xiāng)進(jìn)行赤霉病抗性接種鑒定。蘇麥3號、揚麥158、淮麥20和周麥16分別作為赤霉病抗性鑒定的高抗、中抗、中感和高感對照。

1.2 基因型分析

隨機(jī)剪取每個BC2F2單株的新鮮葉片，利用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)(北京天根生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA；采用相同方法，每個BC2F4品系隨機(jī)剪取10個新鮮葉片，混合后提取基因組DNA。應(yīng)用STS功能標(biāo)記TaHRC-GSM(TaHRC-GSM-F:5′-ATTCCTAC TAGCCGCCTGGT-3′;TaHRC-GSM-R:5′-ACT GGGGCAAGCAAACATTG-3′)檢測BC2F2單株Fhb1的等位基因[23]。PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增結(jié)果檢測參考Li等[22]的方法。利用KASP標(biāo)記GBS20328檢測輪選136和BC2F4品系中是否存在鄭麥9023赤霉病抗性位點Qfhb.7D。KASP標(biāo)記GBS20328引物序列、PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照Zhang等[24]的方法。

1.3 赤霉病抗性評價

2019年，在福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地(27°33′N，118°12′E)進(jìn)行赤霉病田間自然發(fā)病抗性鑒定。于小麥開花后25 d調(diào)查病小穗數(shù)和總小穗數(shù)，每個材料每個重復(fù)調(diào)查10個穗子[22]。嚴(yán)重度計算采用下面公式：嚴(yán)重度(%)=病小穗數(shù)/總小穗×100%[25]。2019年和2020年在河南省中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院新鄉(xiāng)試驗基地(35°31′N，113°85′E)以及2019年在北京中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所溫室(39°91′N，116°27′E)采用單花滴注法進(jìn)行人工接種鑒定。孢子液制備參考Bai等[26]的方法，在開花初期，用聯(lián)動移液器將10 μL(約 1 000個孢子)禾谷鐮孢菌分生孢子懸浮液注入中間小穗，接種麥穗套袋保濕48 h，然后去掉袋子，用彌霧裝置定時噴水保濕至接種后15 d。接種21 d后，調(diào)查病小穗數(shù)并計算嚴(yán)重度[19]。

試驗采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，設(shè)2次重復(fù)。2019年南平和2019年新鄉(xiāng)兩個環(huán)境采用田間種植，1 m行長，行距30 cm，每行播種20粒種子；2019年新鄉(xiāng)環(huán)境采用溫室花盆種植，每盆(直徑25 cm)種15粒種子，出苗后保證每盆10株苗，每個材料種2盆。2020年新鄉(xiāng)環(huán)境BC2F4品系種植方式同2019年新鄉(xiāng)環(huán)境。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2019數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行描述性統(tǒng)計。利用IBM SPSS Statistics 22軟件通過LSD方法進(jìn)行多重比較分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BC2F2群體 Fhb1等位基因檢測結(jié)果

利用STS功能標(biāo)記TaHRC-GSM對BC2F26個群體的Fhb1等位基因進(jìn)行檢測，部分后代單株的檢測結(jié)果如圖1所示。在BC2F2群體1(158株)、群體2(161株)、群體3(152株)、群體4(43株)、群體5(181株)和群體6(177株)中，分別有29株、40株、42株、19株、60株和43株攜帶純合Fhb1抗病等位基因(Fhb1-R)。淘汰農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較差的單株后，BC2F2群體1、群體2、群體3、群體4、群體5、群體6分獲得純合Fhb1-R基因型27株、17株、24株、19株、41株和33株，衍生后代將用于赤霉病抗性評價。

2.2 BC2F3群體赤霉病抗性表現(xiàn)

從表1和表2可以看出，部分對照品種間的病小穗數(shù)和嚴(yán)重度在每個環(huán)境下均存在顯著差異(表1和2)。在南平和北京環(huán)境下，蘇麥3號和揚麥158的病小穗數(shù)和嚴(yán)重度均顯著低于淮麥20和周麥16(P<0.05)。與周麥16比較，淮麥20表現(xiàn)出較好的赤霉病抗性，在南平、新鄉(xiāng)和北京三個環(huán)境下病小穗數(shù)比周麥16分別少7.5個、5.4個和8.8個；平均嚴(yán)重度分別降低8.8%、23.3%和36.1%，差異均顯著(P<0.05)。從對照品種赤霉病抗性表現(xiàn)看，各環(huán)境下發(fā)病充分，適合進(jìn)行赤霉病抗性表型評價。

6個BC2F3群體在南平、新鄉(xiāng)和北京三個環(huán)境的赤霉病抗性表現(xiàn)見表1和表2。三個環(huán)境下來自6個群體161個純合Fhb1-R株系的總平均病小穗數(shù)比周麥16分別減少8.1個、6.1個和9.6個，比淮麥20分別減少0.6個、0.7個和0.8個，比輪選136分別減少0.2個、1.0個和1.4個；總平均嚴(yán)重度比周麥16分別降低15.1%、26.1%和42.1%，比淮麥20分別降低6.3%、2.8%和6.0%，比輪選136分別降低2.6%、4.8%和5.8%。輪選136與淮麥20之間的病小穗數(shù)和嚴(yán)重度差異均不顯著。

表2 2019年三個環(huán)境6個BC2F3群體的赤霉病嚴(yán)重度比較Table 2 Comparison of FHB severity of the six BC2F3 populations under three environments in 2019 %

來自不同供體的部分回交群體的病小穗數(shù)和嚴(yán)重度存在顯著差異(表1和2)。南平環(huán)境下不同群體間的病小穗數(shù)無顯著差異，但南平環(huán)境下部分群體間的嚴(yán)重度以及新鄉(xiāng)和北京環(huán)境下部分群體間的病小穗數(shù)和嚴(yán)重度均差異顯著?？偟膩碚f，建陽84-2的回交后代(群體5)赤霉病抗性表現(xiàn)較好，抗性較為穩(wěn)定。

2.3 赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20的BC2F3株系

單個環(huán)境下，每個BC2F3群體中病小穗數(shù)和嚴(yán)重度均低于淮麥20的株系個數(shù)不同(表3)。在南平環(huán)境下，6個群體中共有70個株系 (43.5%)的赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20，分布頻率為30.3%～58.8%；新鄉(xiāng)環(huán)境下共有121個株系(75.2%)的赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20，分布頻率為51.9%～89.5%；北京環(huán)境下，同樣有121個株系(75.2%)的赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20，分布頻率為58.3%～90.9%。

表3 2019年單個環(huán)境下赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20的BC2F3株系數(shù)和頻率統(tǒng)計Table 3 Number and frequency of BC2F3 lines with FHB resistance superior to Huaimai 20 under single environment in 2019

有60個BC2F3株系(37.3%)在三個環(huán)境下抗性均低于淮麥20，且表現(xiàn)一致，因此，選擇這些抗性表現(xiàn)穩(wěn)定的株系進(jìn)行進(jìn)一步研究。在南平、新鄉(xiāng)和北京三個環(huán)境下，相比淮麥20，6個BC2F3群體的總平均病小穗數(shù)分別降低 2.2、1.8和2.1個(P<0.05)，平均嚴(yán)重度分別降低11.8%、8.1%和12.7%(P<0.05)(表4)。

表4 三個環(huán)境下赤霉病抗性一致優(yōu)于淮麥20的BC2F3株系表現(xiàn)Table 4 Performances of the selected BC2F3 lines with FHB resistance superior to Huaimai 20 under three environments

2.4 苗頭品系篩選

2020年在新鄉(xiāng)繼續(xù)對入選的60個BC2F3株系的122個BC2F4品系進(jìn)行赤霉病抗性表型評價(表5)，其中93個品系(76.2%)赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20，36個品系(29.5%)赤霉病抗性達(dá)到中抗對照揚麥158的水平。

表5 赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20的BC2F4品系赤霉病抗性表現(xiàn)(2020，新鄉(xiāng))Table 5 Performances of selected BC2F4 lines with FHB resistance superior to Huaimai 20(2020,Xinxiang)

93個赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20的BC2F4品系平均病小穗數(shù)為5.5個，平均嚴(yán)重度為26.2%，比淮麥20分別降低2.8個和15.5%(P<0.05)。圖2為部分抗赤霉病品系單花滴柱接種后的表型。利用鄭麥9023抗性位點Qfhb.7D連鎖KASP標(biāo)記GBS20328分析發(fā)現(xiàn)，輪回親本輪選136和93個BC2F4品系均攜帶該QTL。這些品系已經(jīng)安排產(chǎn)量比較試驗，用于培育抗赤霉病新品種。

A：蘇麥3號；B：揚麥158；C：淮麥20；D：周麥16；E：抗赤霉病品系RS1612-6-8-2;F：抗赤霉病品系RS1610-26-3-4。A:Sumai 3;B:Yangmai 158;C:Huaimai 20;D:Zhoumai 16;E:Fusarium head blight-resistant line RS1612-6-8-2;F:Fusarium head blight-resistant line RS1610-26-3-4.圖2 單花滴注接種抗赤霉病株系的表型Fig.2 Performance of lines with the resistance to Fusarium head blight using the floret inoculation method

3 討 論

快速培育適合黃淮冬麥區(qū)生態(tài)類型的抗赤霉病小麥品種是小麥生產(chǎn)亟待解決的問題。黃淮冬麥區(qū)不同年份赤霉病發(fā)病程度差異較大，在自然發(fā)病條件下，尤其是在發(fā)病較輕的年份，很難在田間準(zhǔn)確評價赤霉病抗性[15]，這也是制約黃淮冬麥區(qū)抗赤霉病育種的一個關(guān)鍵問題。因此，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)開展抗赤霉病育種顯得尤為重要。本研究利用Fhb1功能標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，結(jié)合骨干親本矮敗小麥近等基因系大群體有限回交，快速把長江中下游麥區(qū)的Fhb1抗性等位基因?qū)朦S淮冬麥區(qū)品種，培育出多個赤霉病抗性較好、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的新品系。這些結(jié)果說明，利用有限回交和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)相結(jié)合的策略，不僅能提高抗赤霉病育種效率，還可以縮短育種周期，快速培育出適合黃淮冬麥區(qū)種植的抗赤霉病品種。

過去育種上利用與Fhb1基因連鎖的SSR標(biāo)記(Gwm533、Gwm493)和STS標(biāo)記(Umn10)將Fhb1抗性等位基因?qū)敫胁〔牧蟻硖岣叱嗝共】剐訹9,12-14,27]。但這些連鎖標(biāo)記具有一定的假陽性，為解決這個問題，Su等[23]根據(jù)候選基因TaHRC的缺失突變，開發(fā)了可用于育種后代大規(guī)模篩選的Fhb1基因功能標(biāo)記。本研究利用這個功能標(biāo)記對回交后代進(jìn)行目標(biāo)基因的跟蹤檢測，提高了抗病基因型選擇的準(zhǔn)確性。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)hb1基因可以有效提高赤霉病抗性，但并不是所有Fhb1-R株系都具有和Fhb1供體一樣的抗性，這與前人的研究結(jié)果一致[21-22,28]。很多供體除了攜帶Fhb1基因外，還攜帶其他抗赤霉病位點，比如蘇麥3號除了攜帶Fhb1外，還攜帶Fhb2和Fhb5[29]。本研究只針對Fhb1基因進(jìn)行目標(biāo)選擇，其他微效基因在Fhb1-R株系中隨機(jī)存在，后代中赤霉病抗性好的Fhb1-R株系可能聚合了這些微效位點，有待進(jìn)一步研究。本研究對三個環(huán)境中赤霉病抗性均優(yōu)于淮麥20的60個BC2F3株系繼續(xù)進(jìn)行選擇，發(fā)現(xiàn)122個BC2F4品系中有93個(76.2%)赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20，說明赤霉病抗性在多環(huán)境中鑒定的重要性，也表明所選BC2F3株系的赤霉病抗性可以穩(wěn)定地遺傳到下一代。由此可見，對于抗赤霉病這種復(fù)雜數(shù)量性狀，在利用Fhb1基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇時，結(jié)合多環(huán)境下的表型評價，才能提高抗赤霉病育種成功的概率。

受體親本的遺傳背景對提高赤霉病抗性有很大影響[5]。劉宗鎮(zhèn)等[30]發(fā)現(xiàn)，赤霉病抗性的超親現(xiàn)象主要存在于赤霉病抗性為中感以上的親本雜種后代，而在高感親本后代中很難選出抗赤霉病品種。如被廣泛利用的抗赤霉病小麥品種蘇麥3號是由中感赤霉病的臺灣小麥與中感赤霉病的阿夫(Funo)雜交選育而成。本研究發(fā)現(xiàn)，在對赤霉病有一定抗性的輪選136的遺傳背景下，回交群體平均病小穗數(shù)和嚴(yán)重度均低于淮麥20或與之相當(dāng)，但Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在高感赤霉病的輪選13背景下，回交群體的赤霉病抗性水平明顯低于輪選136遺傳背景，表明遺傳背景對基因的抗性有重要影響，這與前人的研究結(jié)果[31-33]一致。

輪回親本輪選136是通過周麥16與鄭麥9023雜交再與周麥16回交選育而成，其赤霉病抗性明顯優(yōu)于周麥16[22]。Zhang等[24]報道，鄭麥9023攜帶赤霉病抗性位點Qfhb.7D，該位點在不同環(huán)境下可解釋6.15%～9.32%的表型變異。本研究發(fā)現(xiàn)，輪選136的Qfhb.7D基因型與鄭麥9023相同，在93個赤霉病抗性優(yōu)于淮麥20的BC2F4品系中均含有Qfhb.7D，推測這些品系的赤霉病抗性可能歸因于輪選136抗性位點Qfhb.7D與Fhb1基因之間的累加效應(yīng)。后續(xù)有必要利用遺傳群體進(jìn)一步研究Fhb1基因和抗性QTLQfhb.7D的聚合效應(yīng)。

綜上所述，通過把來源于長江流域小麥品種的Fhb1基因?qū)朦S淮冬麥區(qū)品種，可有效提高黃淮冬麥區(qū)品種對赤霉病的抗性。有限回交結(jié)合Fhb1分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，配合田間自然發(fā)病和人工接種鑒定，是快速提高黃淮冬麥區(qū)品種赤霉病抗性的有效途徑。在抗赤霉病育種中，應(yīng)注意遺傳背景的選擇和多個抗病基因的累加效應(yīng)。