張志勇，唐愛華，李雙蕾，許淑華，高 美

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧 530000； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西 南寧 530000）

近年來，我國糖尿病腎?。―N）發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其中香港DN發(fā)病率達(dá)31.6%［1］，目前尚無治愈方法，只能通過飲食控制，以及采用降糖、控制血壓、減少尿蛋白、護腎等對癥治療，療效欠佳。研究DN的新靶點和開發(fā)新藥物成為公眾關(guān)注的焦點。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是研究中藥活性成分控制基因靶點表達(dá)，通過信號通路治療疾病的新型方法學(xué)，是初步探討中藥治療疾病作用機制的新思路。中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）包含499味草藥及每味草藥的化合物成分（超29000個），針對每個化合物成分提供了較全面的人體吸收、分布、代謝（ADME）等評價數(shù)據(jù)，同時提供了潛在活性成分的靶標(biāo)及其相關(guān)疾病信息，形成了針對每味草藥的藥物－靶標(biāo)－疾病網(wǎng)絡(luò)，為從系統(tǒng)水平研究中藥作用機理提供了依據(jù)［2］。此外，該平臺提供了許多中草藥的藥物代謝動力學(xué)數(shù)據(jù)，如口服生物利用度、藥物相似度、腸上皮通透性、血腦屏障、水溶性等，廣泛用于藥物成分的篩選和評估［3］。本研究中基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘出黃連治療DN的基因靶點和信號通路，探析其作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分及其相關(guān)靶點

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索黃連的所有化學(xué)成分，將口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）作為篩選參數(shù)，對藥物所有成分進行篩選。設(shè)OB＞30%，DL＞0.18［4］，篩選出候選活性成分。選擇TCMSP數(shù)據(jù)庫中Related Targets項，可得藥物名稱等相關(guān)靶點信息。

1.2 靶點基因轉(zhuǎn)換

使用Perl語言對所有DN相關(guān)的靶點基因進行名稱轉(zhuǎn)換，得到靶點基因的標(biāo)準(zhǔn)名稱。

1.3 疾病相關(guān)基因靶點預(yù)測

通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫搜索糖尿病腎病英文名diabetic nephropathy，得到所有與DN相關(guān)的靶點基因，作為疾病的候選靶點基因。

1.4 藥物靶點基因與疾病靶點基因交集

通過R 3.6.3軟件分析出藥物和疾病的共同靶點基因，繪制venny圖［2］。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將藥物和疾病的共同靶點基因?qū)胛募?，進行中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可視化，利用Cytoscape 3.5.0軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，可得到疾?。钚猿煞郑悬c基因相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖；利用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，用R軟件繪制出PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因柱狀圖，對黃連治療DN潛在的靶點基因進行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及其相關(guān)基因靶點

通過篩選，共得到14種候選藥效成分，主要包含眾多生物堿類，詳見表1。據(jù)此得到所有藥物相關(guān)靶點信息，并通過轉(zhuǎn)換得到靶點基因的標(biāo)準(zhǔn)名稱。

表1 黃連活性成分Tab.1 The active components of Coptidis Rhizoma

2.2 疾病靶點預(yù)測

共檢索到3273個靶點基因，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫3082個，OMIM數(shù)據(jù)庫191個。

2.3 藥物靶點基因與疾病靶點基因交集

共得到101個靶點基因。

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

疾病－活性成分－靶點基因相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖中可發(fā)現(xiàn)6個治療DN的關(guān)鍵有效活性成分，分別為小檗堿、小檗紅堿、表小檗堿、槲皮素、黃連堿、甲基黃連堿（見圖1）。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共有101個節(jié)點，1680條作用連線，平均節(jié)點度33.3，平均局部類聚系數(shù)0.673。PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因柱狀圖見圖2。

圖1 疾?。钚猿煞郑悬c基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Disease－active components－target genes network

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因柱狀圖Fig.2 PPI network histogram of core genes

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析圖見圖3，KEGG富集分析圖見圖4?？梢?，黃連治療DN涉及靶點的生物學(xué)功能及信號通路眾多，但與DN密切相關(guān)靶點的生物學(xué)功能涉及受體結(jié)合、酶的活性、氧化還原等，主要富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性和RNA聚合酶Ⅱ特異性、細(xì)胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、絲氨酸水解酶活性、激酶調(diào)節(jié)活性、氧化還原酶活性，作用于成對的供體，與分子氧結(jié)合或還原等（見表2）。密切相關(guān)的信號通路主要包括AGE－RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子－1（HIF－1）信號通路（見表3）［3］。

圖3 GO功能富集分析圖Fig.3 GO function enrichment analysis diagram

圖4 KEGG富集分析圖Fig.4 KEGG enrichment analysis diagram

表2 黃連治療DN的靶點功能信息Tab.2 Target function information of Coptidis Rhizoma in the treatment of DN

表3 黃連治療DN的主要通路信息Tab.3 The main pathway information of Coptidis Rhizoma in the treatment of DN

3 討論

中醫(yī)稱糖尿病為消渴病，DN由消渴日久發(fā)展而來，飲食無度、胃強脾弱、脾氣虛、太陰濕阻、郁阻中焦、氣機壅滯、化為燥熱、消竭腎水、陰虛火旺、引起下焦?jié)駸釗p傷腎絡(luò)；腎虛陰陽失衡，氣化失司，水液潴留。黃連具有降血糖、消炎、抗氧化、調(diào)血脂等作用，能清邪熱，化水濕，《名醫(yī)別錄》中記載黃連“主治五藏冷熱……止消渴”，《本草綱目》中指出其主治“消渴尿多”“小便如油”［4］。有研究表明，黃連可激活蛋白激酶、抑制肝臟將非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖、促進B細(xì)胞修復(fù)、促進胰島素受體相關(guān)基因表達(dá)、提高胰高血糖素樣肽－1（GLP－1）水平等，從而發(fā)揮降血糖效果［5］。黃連所含黃連總生物堿能降低DN模型大鼠腫瘤壞死因子－α（TNF－α）和肌酐水平，改善腎組織細(xì)胞損傷［6］。長期應(yīng)用黃連可逐漸緩解腎小球病理改變，延緩疾病進程，從而達(dá)到治療DN的目的［7］。黃連及其復(fù)方不僅控制血糖、血壓效果較佳，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂和減少蛋白尿排泄方面也有顯著療效［8］。

小檗堿、槲皮素是黃連治療DN的主要活性成分。由疾?。钚猿煞郑悬c基因網(wǎng)絡(luò)圖可見，小檗堿、槲皮素所控制的靶點基因也是DN的靶點基因，說明小檗堿、槲皮素可通過這些靶點基因改善DN癥狀。小檗堿可通過磷脂酰肌醇－3激酶／蛋白激酶（PI3K／AKT）途徑降低體內(nèi)PI3K、磷酸化AKT水平，改善腎功能，抑制足細(xì)胞功能障礙，從而治療DN［9］；槲皮素是黃酮類化合物，對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的DN大鼠有抗氧化作用［10］；表小檗堿、黃連堿可抑制醛糖還原酶活性，能預(yù)防糖尿病并發(fā)癥，但未明確指出可治療DN［11］。目前未見小檗紅堿、甲基黃連堿治療DN的文獻報道，需進一步研究。說明連治療DN具有多成分的特點。

由PPI網(wǎng)絡(luò)圖中可見，節(jié)點數(shù)排列前10的基因分別為蛋白激酶1（AKT1）、白細(xì)胞介素6（IL－6）、血管內(nèi)皮因子A（VEGFA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、JUN原癌基因（JUN）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2或COX－2）、表皮生長因子（EGF）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP－9）、表皮生長因子受體（EGFR）等，推測這些基因可能是黃連干預(yù)DN的主要基因靶點。余紅等［12］研究發(fā)現(xiàn)，減弱AKT1蛋白的表達(dá)，能部分抑制腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程，減少纖維連接蛋白（FN）沉積，改善DN。IL－6是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，在DN發(fā)病過程中扮演著重要角色。IL－6－174G／C基因多態(tài)性與DN的風(fēng)險相關(guān)［13］。在高糖環(huán)境誘導(dǎo)下，IL－6可能通過激活Janus kinase2（JAK2）／STAT3信號通路，對足細(xì)胞肥大的形成起到重要作用，從而加速DN的發(fā)展［14］。CASP基因是半胱氨酸家族的一部分，在細(xì)胞的衰老、凋亡等生理過程中起重要作用。ELENA等［15］發(fā)現(xiàn)，DN的生理病理機制有著和細(xì)胞損傷、凋亡一樣特征的超微機構(gòu)變化，認(rèn)為DN的發(fā)生與發(fā)展可能與CASP基因相關(guān)。COX－2與DN有關(guān)，其在腎臟中的上調(diào)會導(dǎo)致腎小球損傷和蛋白尿的產(chǎn)生，選擇性抑制COX－2可延緩腎損傷的進展［16］。尿液EGF與DN進展密切，在區(qū)分早期DN和臨床DN，以及在非DN患者中區(qū)分微量蛋白尿時顯示了良好的應(yīng)用價值，提示EGF可作為DN的特異性診斷標(biāo)志物［17］。說明黃連治療DN具有多靶點特點。

黃連的活性成分通過AGE－RAGE、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、HIF－1等信號通路治療DN［5］。小檗堿可中斷AGE－RAGE信號通路，降低細(xì)胞中AGEs和RAGE水平，并能抑制細(xì)胞膜增殖［18］。槲皮素可抑制AGE－RAGE信號通路，減少血管損害，降低蛋白尿水平［19］。流體剪切應(yīng)力代表血流施加在血管內(nèi)皮的摩擦力，低流體剪切力有助于血管動脈粥樣硬化的發(fā)展［20］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，小檗堿具有多種藥理活性，包括降血糖、調(diào)血脂、抗炎等活性，可發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，此外，小檗堿的抗炎和抗氧化特性能抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和改善內(nèi)皮功能障礙［21］，從而改善腎臟血流，增加流體剪切力，達(dá)到治療DN的目的。HIF－1信號通路在炎性反應(yīng)中激活VEGFA的表達(dá)，以抵消缺氧，并防止腎臟組織損傷［22］。VEGFA在DN的發(fā)病機理中起重要作用，過表達(dá)將促進微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并加劇血管疾病的發(fā)生。KALLINIKOU等［23］研究表明，VEGFA可作為生物標(biāo)志物識別DN的進展，并在DN患者的血漿和尿液中具有較高的表達(dá)水平。小檗堿能激活HIF－1A信號通路，抑制DN模型大鼠的腎小管上皮細(xì)胞凋亡［24］；槲皮素能通過調(diào)節(jié)HIF－1A和VEGFA水平改善腎功能，降低蛋白尿水平［25－26］。

綜上所述，本研究從分子學(xué)角度出發(fā)，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析黃連的中藥活性成分，挖掘出治療DN的靶點基因，發(fā)現(xiàn)黃連是通過小檗堿、槲皮素等成分，AGE－RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路、HIF－1信號通路等來治療DN。但本研究范圍僅局限于數(shù)據(jù)庫，仍需進一步進行臨床試驗驗證。