馮 媛，鄭玉光，劉 巖，張清清，2△

（1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200； 2.河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050200；3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 石家莊 050200；4.天津天士力中藥資源科技發(fā)展有限公司，天津 300000）

關(guān)黃柏為蕓香科植物黃檗Phellodendron amurenseRupr.的干燥樹皮，有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡功效，主要用于治療黃疸瀉痢、腸痔、口瘡、熱淋澀痛、遺精、目熱赤痛等病癥［1］。其活性成分主要包括生物堿、內(nèi)酯、酚酸、苯丙素等［2－3］，具有抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化、降血糖、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性［4－6］。關(guān)黃柏中以生物堿類成分最具代表性，結(jié)構(gòu)類型多樣，且具有較好的藥理活性，一直以來備受關(guān)注［7］。相較于正交試驗法，響應(yīng)面法試驗周期更短，求得的回歸方程準(zhǔn)確度更高，并可研究幾種因素間的交互作用［8－12］。本研究中以小檗堿、巴馬汀等5個代表性生物堿成分的總含量為指標(biāo)，基于響應(yīng)面法優(yōu)化關(guān)黃柏藥材中生物堿的提取工藝，為關(guān)黃柏藥材的質(zhì)量控制及開發(fā)利用提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；QUINTIX125D－1CN型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為十萬分之一）；Eppendorf Centrifuge 5418型離心機（德國Eppendorf AG公司）；Milli－Q型超純水儀（美國Milipore公司）；KQ－300DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

關(guān)黃柏飲片（河北省安國市祁澳中藥飲片有限公司、批號為1908917171，河北省安國市深豪藥業(yè)有限公司、批號為190602151，河北省安國市金康迪中藥材飲片有限公司、批號為1804001C），經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光教授鑒定為正品；木蘭花堿對照品（批號為19082004，含量為99.84%），鹽酸藥根堿對照品（批號為19072609，含量為98.62%），小檗紅堿對照品（批號為19050701，含量為98.71%），小檗堿對照品（批號為17110105，含量為98.95%），巴馬汀對照品（批號為18022604，含量為99.01%），均購自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈為色譜純，甲醇為色譜純和分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 生物堿成分含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min時10%A→12%A，20～27 min時12%A→22%A，27～36 min時22%A→26%A，36～65 min時26%A→40%A，65～68 min時40%A→75%A，68～70 min時75%A→10%A）；檢測波長：265 nm；流速：1 mL／min；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、小檗堿、巴馬汀對照品各適量，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加入70%甲醇定容，制成單標(biāo)母液，分別稀釋，配制成分別含木蘭花堿0.0049 mg／mL、鹽酸藥根堿0.0006 mg／mL、小檗紅堿0.0002 mg／mL、巴馬汀0.0062 mg／mL、小檗堿0.0187 mg／mL的混合對照品溶液。取關(guān)黃柏藥材粉末0.5 g，精密稱定，浸泡30 min后置100 mL具塞三角瓶中，加入30 mL甲醇，25℃下超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取40 min，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，混勻，取續(xù)濾液，13000 r／min離心5 min，取上清液，置5 mL EP管中，稀釋10倍，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取上述混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)按木蘭花堿峰計算應(yīng)不低于3000；分離度均大于1.5，基線分離良好。

圖1 高效液相色譜圖1.magnoflorine 2.jatrorrhizine hydrochloride 3.berberrubine 4.palmatine 5.berberine A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.1.2項下混合對照品溶液1，3，5，10，15，20μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以各對照品質(zhì)量濃度（mg／mL，X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程和線性范圍，詳見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the linear relation test（n＝6）

精密度試驗：1）日內(nèi)精密度，精密量取混合對照品溶液適量，連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿的RSD分別為0.15%，0.51%，0.46%，0.13%，0.17%（n＝6），表明儀器的日內(nèi)精密度良好。2）日間精密度，精密量取混合對照品溶液適量，連續(xù)進樣測定3 d，每日1次，記錄峰面積。結(jié)果木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿的RSD分別為0.13%，1.51%，0.11%，1.42%，1.87%（n＝3），表明儀器的日間精密度良好。

重復(fù)性試驗：取同一批關(guān)黃柏藥材粉末，精密稱定，按2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積及計算含量。結(jié)果木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿含量的RSD分別為0.78%，1.54%，1.15%，1.87%，1.83%（n＝6），表明該方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一關(guān)黃柏供試品溶液，分別在室溫下放置0，3，5，8，13，20，24 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿的RSD分別為1.77%，1.94%，1.78%，1.72%，1.12%（n＝7），表明供試品溶液室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取已知含量的關(guān)黃柏藥材粉末共6份，各0.25 g，精密稱定，分別加入相應(yīng)對照品溶液按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定并計算加樣回收率。結(jié)果，木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿的加樣回收率分別為102.33%，104.53%，102.76%，100.34%，102.62%（n＝6），RSD分別為1.10%，0.27%，1.10%，0.78%，0.99%（n＝6）。

2.2 單因素試驗

2.2.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)

取關(guān)黃柏藥材樣品粉末0.5 g，精密稱定，平行6份，液料比為60 mL／g，分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%，30%，50%，70%，90%、100%的甲醇，25℃超聲提取40 min，13000 r／min離心5 min，取上清液，置5 mL EP管中，稀釋10倍，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，進行液相分析，得5個生物堿總含量，其含量與甲醇體積分?jǐn)?shù)的變化關(guān)系見圖2。可見，生物堿總含量隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增加，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，生物堿總含量最大。故選取甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，70%，90%3個水平進行后續(xù)試驗。

2.2.2 液料比

取關(guān)黃柏藥材樣品粉末0.5 g，精密稱定，平行處理6份，甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%，在不同液料比（20，40，60，80，100，120 mL／g）下，25℃超聲提取40 min，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，13000 r／min離心5 min，取上清液，置5 mL EP管中，稀釋10倍，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進行液相分析，得5個生物堿的總含量，其含量與液料比的變化關(guān)系見圖2?？梢姡S著液料比的增加，生物堿總含量先增加后減少，液料比在30 mL／g時，生物堿的總含量達到最大。故選取液料比40，60，80 mL／g 3個水平進行后續(xù)試驗。

2.2.3 提取時間的影響

取關(guān)藥材樣品粉末0.5 g，精密稱定，平行處理5份，液料比為60 mL／g，加入70%甲醇，分別超聲處理15 min、30 min、40 min、50 min、1 h（25℃）。生物堿總含量與料液比的變化關(guān)系見圖2?？梢姡S著提取時間的延長，生物堿總含量先增加后減少，當(dāng)提取時間為40 min時，生物堿總含量最大。故選取提取時間30，40，50 min 3個水平進行后續(xù)試驗。

圖2 單因素試驗結(jié)果A.Methanol volume fraction B.Liquid－material ratio C.Extration timeFig.2 Results of the single factor test

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計

以5個生物堿總含量（Y）為響應(yīng)值，提取溶劑體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時間（B）、液料比（C）3個因素為自變量，且每個自變量選取低、中、高3個水平，對關(guān)黃柏生物堿超聲提取工藝進行三因素三水平研究，使用Design－Expert 8.0.6軟件，采用Box－Behnken原理進行中心組合設(shè)計，因素水平見表2，Box－Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表2 因素水平表Tab.2 The factor levels

2.3.2 方差分析與顯著性檢驗

運用Design－Expert 8.0.6軟件對表2中的試驗結(jié)果進行擬合分析，得二次多項回歸方程Y＝3.03－0.041A＋0.024 B＋0.015 C－2.5×10－3AB＋1×10－2AC＋0.05 BC－0.22 A2－0.10 B2－0.13 C2（R2＝0.8789），說明該模型擬合度較好，試驗誤差較?。?3］。進一步對方程進行方差分析，結(jié)果見表4。

由表4可知，模型P＝0.0163＜0.05，說明本回歸模型自變量與因變量的回歸關(guān)系顯著，失擬項P＝0.46＞0.05，說明二次多項回歸方程擬合程度良好，本試驗具有統(tǒng)計學(xué)意義［14］。各因素對關(guān)黃柏生物堿提取率的影響大小為A＞B＞C，二次項A2，B2，C2對響應(yīng)值的影響顯著，說明各因素與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系。交互項對生物堿總含量影響的強弱為BC＞AC＞AB，說明超聲時間和液料比對響應(yīng)值的影響較明顯。

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of ANOVA

2.3.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)響應(yīng)面圖（見圖3）評價試驗因素之間的交互強度，優(yōu)選出最佳提取工藝。由圖3可知，因素A的曲面較陡峭，說明甲醇體積分?jǐn)?shù)相對于其他2個因素對生物堿成分提取效率的影響較大。BC交互作用較強，說明提取時間與液料比的交互作用對生物堿總含量的影響顯著，AB和AC交互作用較弱，說明甲醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間、液料比與提取時間的交互作用對生物堿總含量的影響較小。

圖3 各因素與生物堿總提取量的響應(yīng)面圖A.Ultrasonic time and methanol volume fraction B.Liquid－material ratio and methanol volume fraction C.Liquid－material ratio and ultrasonic timeFig.3 Response surface diagram of each factor and total extraction amount of alkaloids

2.4 最優(yōu)工藝與驗證試驗

優(yōu)選出的最佳提取工藝為：提取時間為41.35 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為68.17%，液料比為61.64 mL／g。結(jié)合實際，同時為方便操作，最終確定最優(yōu)提取工藝為取0.5 g的關(guān)黃柏藥材樣品粉末，加入68%甲醇，超聲提取41 min，液料比為62 mL／g。分別選取3批關(guān)黃柏藥材飲片，在上述最優(yōu)工藝條件下進行驗證試驗。結(jié)果生物堿成分總含量分別為3.030，2.979，3.007 mg／g，平均3.005 mg／g（RSD＝0.85%），與模型預(yù)測值的相對誤差為0.59%，表明建立的模擬回歸方程擬合度較好，優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可靠。

3 討論

關(guān)黃柏藥材中生物堿提取方法主要包括傳統(tǒng)的水煎煮法、酸水法、石灰水法、乙醇回流法等［15－16］，提取時間較長、能耗大，一些熱敏性的有效成分易被破壞，且提取效率較低。相對于傳統(tǒng)的提取方法，超聲提取法、酶輔助提取法可彌補上述缺點［17］，但提取成本較高。綜合考慮，本研究中采取超聲法提取關(guān)黃柏藥材中的生物堿成分。

前期通過預(yù)試驗對不同超聲次數(shù)（1，2，3次）、不同浸泡時間（15 min、30 min、1 h、2 h、4h、12 h）及不同種類提取溶劑［包括甲醇、鹽酸－甲醇（1∶100，V／V）、乙酸－甲醇（1∶100，V／V）、鹽酸－乙醇（1∶100，V／V）、乙醇］進行考察，結(jié)果表明，生物堿總含量在超聲1次、提取溶劑為甲醇時最高。浸泡時間為4 h時生物堿總含量最高，其次為浸泡30 min，為提高提取效率，綜合考慮，最終選擇甲醇為提取溶劑，浸泡30 min，超聲1次。此外，巴馬汀和小檗堿均屬原小檗堿型生物堿，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，高效液相色譜圖中保留時間十分接近，且巴馬汀在關(guān)黃柏和川黃柏藥材中的含量差異十分顯著。

2020年版《中國藥典》以鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的含量作為關(guān)黃柏藥材的質(zhì)量評價指標(biāo)［1］，在目前已有的關(guān)黃柏最佳提取工藝研究中，多數(shù)僅以小檗堿成分作為考察指標(biāo)［17］。為更全面、準(zhǔn)確地評判關(guān)黃柏藥材的質(zhì)量，本試驗中選取了含量較高、藥理作用研究較充分的木蘭花堿、鹽酸藥根堿、小檗紅堿、巴馬汀和小檗堿的總含量，作為評價指標(biāo)。該方法相較于目前已有的僅以小檗堿作為對照品考察關(guān)黃柏提取工藝的研究更嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)。目前有關(guān)關(guān)黃柏藥材最佳提取工藝的研究中，大多都采用正交試驗設(shè)計法。而響應(yīng)面法可連續(xù)對試驗各個水平進行分析，在單因素試驗基礎(chǔ)上，找出與原預(yù)設(shè)水平相比最優(yōu)的組合條件［18－19］，與正交試驗相比，試驗結(jié)果的精度和真實度更高、直觀性更強［20－21］。但也有其局限性，如響應(yīng)面試驗前的單因素最佳水平選取錯誤，會使響應(yīng)面試驗無法得到預(yù)期結(jié)果［22］。本試驗中通過單因素試驗結(jié)合Box－Behnken響應(yīng)面法，優(yōu)化得到關(guān)黃柏藥材中生物堿的最佳提取工藝，操作簡便、效率高、穩(wěn)定可靠。