沈君劼 林俊卿 索金龍 鮑丙波 柴益民 鄭憲友

周圍神經(jīng)損傷是指因創(chuàng)傷等造成的神經(jīng)軸突中斷或斷裂，從而影響神經(jīng)傳導(dǎo)功能，導(dǎo)致患者出現(xiàn)軀干及四肢的感覺、運(yùn)動(dòng)功能及交感神經(jīng)功能障礙，可嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。針對(duì)周圍神經(jīng)損傷的治療方式包括自體神經(jīng)移植、神經(jīng)移位修復(fù)、神經(jīng)松解減壓等。這些治療方式各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中自體神經(jīng)移植是臨床治療周圍神經(jīng)損傷的常用方法和“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，但其仍存在一些不足之處，如供區(qū)損傷、移植物來(lái)源有限以及移植后神經(jīng)粗細(xì)不匹配等。

近年，生物工程技術(shù)及組織工程化神經(jīng)技術(shù)逐漸被應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床治療中。組織工程化神經(jīng)即應(yīng)用“支架材料-細(xì)胞-生長(zhǎng)因子”復(fù)合物橋接神經(jīng)缺損的斷端，以達(dá)到修復(fù)缺損神經(jīng)的解剖結(jié)構(gòu)及功能連續(xù)性的目的[2]。本文就組織工程化神經(jīng)中支架材料、種子細(xì)胞及生長(zhǎng)因子的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 支架材料

支架材料是組織工程的核心要素，其要求具備以下性能：①良好的親水性及生物相容性，以有利于種子細(xì)胞黏附并降低移植后的免疫排斥反應(yīng)；②生物可降解性，以滿足軸突再生速率與支架降解速率的匹配；③優(yōu)良的機(jī)械性能，以避免外部組織壓迫引起內(nèi)壁坍塌，阻礙軸突再生[3]。目前，組織工程神經(jīng)導(dǎo)管領(lǐng)域應(yīng)用較多的支架材料包括可降解聚合材料、脫細(xì)胞材料及碳納米材料。

1.1 可降解聚合材料

盡管早期研究證實(shí)不可降解導(dǎo)管也具有一定的周圍神經(jīng)修復(fù)作用，但殘留材料引起的排異反應(yīng)限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。目前，組織工程神經(jīng)導(dǎo)管的材料選擇從應(yīng)用人工或天然可降解材料到開發(fā)交聯(lián)技術(shù)聚合人工/天然材料，已取得較大進(jìn)展[4]。近年來(lái)常用天然材料包括蛋白質(zhì)類(絲素、膠原等)和多糖類(明膠、殼聚糖、纖維素、藻酸鹽等)，常用人工材料主要包括脂肪多元脂類、導(dǎo)電聚合物及水凝膠材料[5-8]。由于天然可降解材料具有優(yōu)良的生物相容性、親水性，而人工可降解材料能保證支架的可調(diào)機(jī)械性，因此復(fù)合支架構(gòu)建是生物工程的發(fā)展趨勢(shì)，并有望在組織工程神經(jīng)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。

為進(jìn)一步提升生物支架的綜合性能，近年來(lái)對(duì)于可降解聚合材料開發(fā)的熱點(diǎn)逐漸延伸到材料的化學(xué)改性以及3種以上材料的交聯(lián)復(fù)合方面。Luo等[9]將明膠賦予甲基丙烯酸酐官能團(tuán)，制備成甲基丙烯酰胺基明膠(GelMA)神經(jīng)導(dǎo)管。他們開展的體外實(shí)驗(yàn)表明，該水凝膠三維結(jié)構(gòu)更適合神經(jīng)生長(zhǎng)，并具有促血管再生和促神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的能力。Lopez-Silva等[10]將具有多肽結(jié)構(gòu)的自組裝水凝膠導(dǎo)管用于大鼠周圍神經(jīng)卡壓模型治療。他們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比該水凝膠導(dǎo)管能明顯加快神經(jīng)纖維再髓鞘化和促進(jìn)功能恢復(fù)。此外，也有學(xué)者提出使用乙?；男詺ぞ厶腔鶎?dǎo)電復(fù)合材料。大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，該材料具有良好的生物相容性、導(dǎo)電性和可降解性[11]。以上研究表明，通過(guò)技術(shù)改性及材料的交聯(lián)復(fù)合，可進(jìn)一步提高可降解聚合材料在神經(jīng)導(dǎo)管研究中的價(jià)值。

1.2 脫細(xì)胞材料

脫細(xì)胞材料去除細(xì)胞成分而保留了細(xì)胞外基質(zhì)和大部分生長(zhǎng)因子，其在降低免疫反應(yīng)的同時(shí)可更接近自體神經(jīng)的三維結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)神經(jīng)再生具有極大應(yīng)用價(jià)值。周圍神經(jīng)修復(fù)材料包括血管、肌肉、神經(jīng)等[12-13]。Li等[14]在臨床研究中使用人去細(xì)胞神經(jīng)導(dǎo)管結(jié)合對(duì)側(cè)C7神經(jīng)移位術(shù)治療臂叢神經(jīng)損傷，通過(guò)4年隨訪發(fā)現(xiàn)治療組的預(yù)后功能恢復(fù)更滿意。由于同種來(lái)源脫細(xì)胞支架的來(lái)源有限，異種來(lái)源脫細(xì)胞支架的使用拓寬了其應(yīng)用范圍。近年文獻(xiàn)報(bào)道的異種脫細(xì)胞材料來(lái)源包括大鼠、小鼠、兔、豬等[15]，它們均在體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)有利于種子細(xì)胞黏附、增殖以及軸突再生。其中，豬來(lái)源異種脫細(xì)胞神經(jīng)導(dǎo)管因其組織結(jié)構(gòu)更接近人體，被認(rèn)為最有望替代同種脫細(xì)胞支架。

1.3 碳納米材料

石墨烯碳納米材料具有良好的導(dǎo)電性和機(jī)械強(qiáng)度，在組織工程中有廣闊的應(yīng)用前景。過(guò)去數(shù)年，石墨烯納米材料在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用已取得很大進(jìn)步。Huang等[16]將施萬(wàn)細(xì)胞孵育在石墨烯材料表面，發(fā)現(xiàn)其能通過(guò)電信號(hào)刺激促進(jìn)細(xì)胞遷移增殖，并提高神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的表達(dá)。由于周圍神經(jīng)損傷后軸突的定向再生需要借助施萬(wàn)細(xì)胞引導(dǎo)，上述發(fā)現(xiàn)為石墨烯材料的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提供了理論支持。學(xué)者們進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，石墨烯能誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞[16]、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[17]、小鼠胚胎干細(xì)胞[18]等向神經(jīng)譜系細(xì)胞分化發(fā)育，提示不同動(dòng)物來(lái)源及人來(lái)源的干細(xì)胞移植到石墨烯材料后均能生存并分化。由于石墨烯材料親水性較差、脆性較高，應(yīng)用于體內(nèi)研究常需和其他材料進(jìn)行復(fù)合。有學(xué)者制備出石墨烯/聚L-丙交酯-己內(nèi)酯(PLCL)神經(jīng)導(dǎo)管，大幅提升了神經(jīng)細(xì)胞的黏附、增殖能力，以及S100、NGF等神經(jīng)蛋白的表達(dá)水平。有研究將該導(dǎo)管移植入大鼠10 mm坐骨神經(jīng)長(zhǎng)段缺損模型，結(jié)果顯示復(fù)合石墨烯的導(dǎo)管在動(dòng)作電位、神經(jīng)傳導(dǎo)速度和神經(jīng)支配功能恢復(fù)上均優(yōu)于PLCL導(dǎo)管[19]。Park等[20]則利用GelMA水凝膠復(fù)合氧化石墨烯制備出一種可導(dǎo)電神經(jīng)導(dǎo)管，并顯示出其對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)具有促進(jìn)再生的效果。

雖然上述研究結(jié)果均提示石墨烯在修復(fù)神經(jīng)損傷中的優(yōu)越性，但石墨烯碳納米材料難以在體內(nèi)被降解吸收，具有潛在的生物毒性[21]。為解決這一問題，Qian等[22]通過(guò)改進(jìn)制備方法，首次提出層層制模法制備單層和多層復(fù)合石墨烯神經(jīng)導(dǎo)管。該導(dǎo)管的表面微孔有助于營(yíng)養(yǎng)交換和代謝，并通過(guò)確定最佳石墨烯含量來(lái)降低體內(nèi)的細(xì)胞毒性反應(yīng)。近期有學(xué)者使用熒光素標(biāo)記碳納米材料，利用活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)神經(jīng)導(dǎo)管降解后石墨烯在體內(nèi)的分布，這種方法為明確石墨烯碳納米材料的體內(nèi)生物毒性提供了新思路[23]。

2 種子細(xì)胞及其衍生物

種子細(xì)胞及其衍生物是組織工程的原材料之一，它們參與構(gòu)建了組織工程化神經(jīng)導(dǎo)管，同時(shí)也轉(zhuǎn)化為生物組分，促進(jìn)和引導(dǎo)軸突再生，為神經(jīng)再生提供適宜的微環(huán)境。因此，種子細(xì)胞的合理應(yīng)用成為組織工程化神經(jīng)導(dǎo)管成功的關(guān)鍵要素。

2.1 施萬(wàn)細(xì)胞

施萬(wàn)細(xì)胞是周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中極為重要的結(jié)構(gòu)和效應(yīng)細(xì)胞。損傷發(fā)生時(shí)，施萬(wàn)細(xì)胞可增殖并募集巨噬細(xì)胞來(lái)吞噬碎片，后期的軸突再生修復(fù)也需要施萬(wàn)細(xì)胞引導(dǎo)并分泌生長(zhǎng)因子[24]。多項(xiàng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，負(fù)載施萬(wàn)細(xì)胞的組織工程神經(jīng)導(dǎo)管能上調(diào)NGF的表達(dá)，顯著改善受損神經(jīng)的形態(tài)和功能，并促進(jìn)軸突再生[25]。雖然施萬(wàn)細(xì)胞作為種子細(xì)胞具有一定效應(yīng)，但由于它是終末期細(xì)胞，增殖能力較差，提取較為困難，限制了其推廣。有研究人員從大鼠皮膚組織中分離出施萬(wàn)前體細(xì)胞，并將其成功填充于神經(jīng)導(dǎo)管，以促進(jìn)新生軸突髓鞘化及運(yùn)動(dòng)功能的改善[26]。

2.2 干細(xì)胞

干細(xì)胞具有向神經(jīng)元細(xì)胞和類施萬(wàn)細(xì)胞分化的潛能，被認(rèn)為是組織工程學(xué)中的重要細(xì)胞。研究證實(shí)，神經(jīng)導(dǎo)管結(jié)合誘導(dǎo)多能神經(jīng)干細(xì)胞具有促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的能力，并且細(xì)胞移植的免疫原性較低[27]。但是考慮到細(xì)胞存活率、體外擴(kuò)增難易度以及提取途徑等問題，誘導(dǎo)其他組織來(lái)源干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化是目前的研究熱點(diǎn)。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨髓、胚胎、毛囊、脂肪、肌肉等組織來(lái)源的干細(xì)胞均具有向神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能，其修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的效果優(yōu)于單一神經(jīng)導(dǎo)管，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞目前應(yīng)用最為廣泛[28]。由于大部分研究缺少不同干細(xì)胞之間的比較，因此尚不能推斷何種細(xì)胞是神經(jīng)組織工程的最佳種子細(xì)胞。近期，有學(xué)者對(duì)相同支架負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損進(jìn)行比較研究。他們發(fā)現(xiàn)，負(fù)載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的支架細(xì)胞增殖速度更快，但再生神經(jīng)纖維數(shù)目、再生神經(jīng)纖維直徑以及大鼠步態(tài)指數(shù)在兩種支架間未見顯著性差異，因此還需要開展更多對(duì)照研究，來(lái)比較不同種類干細(xì)胞在周圍神經(jīng)修復(fù)中的差異[28]。

值得注意的是，干細(xì)胞移植前的預(yù)處理階段、宿主體內(nèi)微環(huán)境變化均會(huì)對(duì)移植效果產(chǎn)生影響，導(dǎo)致最終分化的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目不足[3]。有研究表明，支架移植入缺損神經(jīng)后僅約5%的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能分化為類施萬(wàn)細(xì)胞[29]。因此，解決細(xì)胞移植后低存活率和低分化率問題是目前種子細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。Zhou等[30]為提升移植干細(xì)胞存活率，引入旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)提高植入細(xì)胞及生長(zhǎng)因子的生物活性。Yurie等[31]利用3D打印技術(shù)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為生物墨水，結(jié)果顯示制備過(guò)程加快，且仿生三維支架結(jié)構(gòu)可提高種子細(xì)胞的生存能力。

近年，基于種子細(xì)胞的基因編輯技術(shù)為提高細(xì)胞移植后的修復(fù)效率提供了新策略。Sultan等[32]通過(guò)基因技術(shù)改造骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞使其具備分泌腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的能力，發(fā)現(xiàn)改造后的細(xì)胞能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞突觸延伸，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。

2.3 細(xì)胞外囊泡

外泌體是一種攜帶信使RNA、微RNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA、蛋白質(zhì)等信息的納米級(jí)細(xì)胞外囊泡。外泌體是重要的細(xì)胞間通訊工具，對(duì)周圍神經(jīng)損傷的發(fā)生發(fā)展和調(diào)控具有重要作用，正逐漸成為組織工程神經(jīng)的研究熱點(diǎn)[33]。學(xué)者們首先發(fā)現(xiàn)施萬(wàn)細(xì)胞外泌體能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞遷移，將其移植入大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型后可顯著促進(jìn)軸突再生[34]。隨后，Guo等[35]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的能力與施萬(wàn)細(xì)胞外泌體在周圍神經(jīng)損傷中的修復(fù)效果相似。Rao等[36]將殼聚糖支架包裹人牙間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體，并將其移植入大鼠坐骨神經(jīng)缺損處，移植12周后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組再生神經(jīng)纖維數(shù)目和神經(jīng)纖維直徑均明顯增加，腓腸肌失神經(jīng)支配現(xiàn)象明顯減輕。上述研究表明，細(xì)胞外泌體能促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的再生，為組織工程神經(jīng)提供了新方法。

3 細(xì)胞因子

周圍神經(jīng)損傷后內(nèi)源性因子常無(wú)法滿足神經(jīng)再生的需求，因此神經(jīng)導(dǎo)管緩釋外源性細(xì)胞因子成為組織工程研究的又一方向。文獻(xiàn)已報(bào)道的神經(jīng)細(xì)胞因子包括NGF、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等[37]。Singh等[38]使用3D打印技術(shù)將NGF填充于組織工程神經(jīng)導(dǎo)管，并將其移植入大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型。他們發(fā)現(xiàn)，NGF組不僅再生神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)更接近于正常神經(jīng)組織，大鼠損傷后步態(tài)功能恢復(fù)也優(yōu)于單純支架組。Fadia等[39]在恒河猴上建立50 mm正中神經(jīng)缺損模型，并將GDNF添加于聚已內(nèi)酯(PCL)支架上，發(fā)現(xiàn)PCL/GDNF治療組相比單純PCL支架組能更顯著地促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞定向遷移及軸突再生。近年來(lái)有學(xué)者嘗試將多種細(xì)胞因子混合，以進(jìn)一步提高組織工程神經(jīng)的修復(fù)效率。Lu等[40]使用水凝膠支架包裹GDNF和血管生長(zhǎng)因子，制備出雙功能性神經(jīng)導(dǎo)管。他們將該導(dǎo)管用于大鼠10 mm坐骨神經(jīng)缺損模型中，發(fā)現(xiàn)雙細(xì)胞因子組神經(jīng)周圍微血管新生更明顯，同時(shí)體內(nèi)電生理信號(hào)和神經(jīng)纖維新生密度均強(qiáng)于單一使用兩種細(xì)胞因子組。

這些體內(nèi)外研究表明了細(xì)胞因子在組織工程神經(jīng)中具有的潛能。此外，鑒于上述兩種細(xì)胞因子組合后效果優(yōu)于單細(xì)胞因子，也有學(xué)者直接使用富血小板血漿等含多種生長(zhǎng)因子的組織成分復(fù)合支架材料來(lái)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)修復(fù)效果與自體神經(jīng)移植接近[41]。由于細(xì)胞因子是大分子蛋白，易受支架材料制備時(shí)的高溫高壓或物理環(huán)境影響，所以組織工程神經(jīng)制備過(guò)程中保持細(xì)胞因子活性也是今后研究的方向[37]。

4 存在問題與展望

周圍神經(jīng)再生解剖及生理功能的復(fù)雜性對(duì)組織工程神經(jīng)導(dǎo)管提出了許多挑戰(zhàn)。近年來(lái)，盡管支架材料、種子細(xì)胞和細(xì)胞因子在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用均有顯著突破，但仍然存在諸多問題亟待解決，如支架材料的降解速率、生物相容性、結(jié)構(gòu)和制備方式的優(yōu)化、種子細(xì)胞的來(lái)源及倫理、移植后存活率、移植劑量、擴(kuò)增后宿主免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子移植量及生物活性的保持等。