陶再進(jìn) 李原歌 劉珅

隨著體育運(yùn)動(dòng)的普及和發(fā)展，肌腱損傷逐步成為一種較常見的疾病。肌腱損傷的主要治療方式為手術(shù)干預(yù)，以恢復(fù)受損肌腱的連續(xù)性。由于損傷的肌腱無法進(jìn)行自我腱性修復(fù)，常形成瘢痕組織，造成功能受損，給患者及其家庭帶來巨大壓力[1]。近年來，應(yīng)用干細(xì)胞治療肌腱損傷已成為臨床和科研的新熱點(diǎn)，干細(xì)胞具有多向分化的潛能及自我更新的能力，其可分化產(chǎn)生多種特定組織類型的細(xì)胞。目前的研究常涉及肌腱干細(xì)胞(TDSC)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)和脂肪源性干細(xì)胞(ADSC)[2-3]。其中，BMSC和ADSC來源廣泛，在特定條件下可分化為肌腱細(xì)胞[4]，常用于肌肉骨骼再生領(lǐng)域的研究[5]。TDSC對(duì)肌腱組織的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持、損傷修復(fù)及再生均有重要意義，且與肌腱細(xì)胞相似，可極大程度地重塑肌腱的生物力學(xué)功能，在運(yùn)動(dòng)型肌腱損傷的治療中常作為首選[6]。因此，如何在肌腱損傷修復(fù)中擴(kuò)增得到大量肌腱細(xì)胞或誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為有組織功能的肌腱細(xì)胞已成為研究熱點(diǎn)。

1 肌腱損傷愈合過程

肌腱為肌肉末端的結(jié)締組織纖維索，由高度特化的平行膠原纖維組成。肌腱損傷后會(huì)通過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行修復(fù)，肌腱的修復(fù)過程分3個(gè)階段，即炎癥期、增殖期和重塑期。

在炎癥期，首先傷處通過血管收縮和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)開始止血，隨后促炎細(xì)胞因子和趨化因子積聚，趨化因子的釋放有利于損傷周圍組織和肌腱鞘中肌腱細(xì)胞的遷移與激活，單核細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞處理壞死碎片，Ⅲ型膠原蛋白開始合成；在增殖期，成纖維細(xì)胞遷移聚集在受損處合成膠原蛋白和蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分。此階段細(xì)胞增多，大量水分被吸收，膠原原纖維之間肌腱細(xì)胞的排列重新建立，Ⅲ型膠原蛋白合成達(dá)頂峰。重塑期在損傷6～8周后開始，其中包含2個(gè)亞階段：第一個(gè)亞階段細(xì)胞和基質(zhì)產(chǎn)量減少，Ⅰ型膠原蛋白合成增加并開始替代Ⅲ型膠原蛋白；第二個(gè)亞階段為成熟期，約在損傷10周后開始，膠原纖維交聯(lián)增加并形成更成熟的纖維化組織，ECM合成增多，細(xì)胞密度和整體合成活性降低。其中，ECM重建是肌腱獲得生物力學(xué)性能的關(guān)鍵過程[7]。

一般認(rèn)為，肌腱愈合包括內(nèi)源性愈合[8]和外源性愈合[9]2種途徑。外源性愈合主要通過腱周組織粘連帶入血運(yùn)形成肉芽組織完成[10]；內(nèi)源性愈合是在充分的滑液營(yíng)養(yǎng)下，腱外膜、腱內(nèi)膜共同參與肌腱細(xì)胞本身的增生，并通過合成和分泌膠原蛋白進(jìn)行修復(fù)[11]。

2 干細(xì)胞治療肌腱損傷愈合

2.1 BMSC

從骨髓中分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是一類非造血干細(xì)胞的亞細(xì)胞群體，故被稱為BMSC。MSC促進(jìn)組織愈合的方式包括：①可分泌多譜系的細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子，以阻斷細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)相鄰細(xì)胞增殖；②可通過細(xì)胞間的直接接觸釋放可溶性免疫抑制因子，以調(diào)控免疫應(yīng)答；③可直接作用在損傷處并分化成多種細(xì)胞。同時(shí)MSC分泌的外泌體生物學(xué)功能廣泛，可調(diào)節(jié)組織微環(huán)境，并促進(jìn)組織修復(fù)和重建[12]。有研究表明，外泌體可抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生并減少瘢痕組織形成，從而促進(jìn)愈合[13]。BMSC有如下特點(diǎn)：來源廣泛，易于取材和分離純化，能夠克隆形成和進(jìn)行自我增殖，并可多向分化成為肌腱、骨、軟骨及脂肪等[14]。同時(shí)，BMSC幾乎無免疫原性，且易于轉(zhuǎn)染、表達(dá)外源基因[15]。實(shí)驗(yàn)研究表明，通過病毒載體向BMSC基因組轉(zhuǎn)染外源目的基因有助于BMSC向肌腱組織細(xì)胞分化[16]。目前，BMSC被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療、基因治療及組織工程領(lǐng)域。Liu等[17]對(duì)空白對(duì)照組、自體肌腱移植組以及應(yīng)用BMSC組兔損傷跟腱的肌腱愈合情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用BMSC組肌腱愈合效果較其他2組更顯著。BMSC可能受到體內(nèi)微環(huán)境中某些因子的影響或調(diào)控，從而定向分化為肌腱組織。Hoffmann等[18]以MSC為種子細(xì)胞，通過肌腱組織工程方法修復(fù)大鼠跟腱損傷模型的受傷跟腱，發(fā)現(xiàn)組織微環(huán)境中的Smad8可促進(jìn)BMSC腱性分化，并形成與正常肌腱細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)完全相同的肌腱細(xì)胞。

此外，細(xì)胞生長(zhǎng)因子在肌腱損傷愈合的修復(fù)過程中也發(fā)揮重要作用。Li等[19]在肌腱-骨界面重建實(shí)驗(yàn)研究中將血小板源性生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)染至BMSC中，發(fā)現(xiàn)與原始的BMSC相比，轉(zhuǎn)染血小板源性生長(zhǎng)因子的BMSC能更有效地增強(qiáng)血管形成和膠原沉積。有研究表明，將轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1基因轉(zhuǎn)染至BMSC中更有利于細(xì)胞有效遷移至損傷處。與原始的BMSC治療組相比，轉(zhuǎn)染TGF-β1基因的BMSC治療組損傷肌腱的愈合速度和ECM的重建速度更快，膠原蛋白合成增加更多，尤其是Ⅰ型膠原蛋白生成更快，且肌腱最大負(fù)荷能力和彈力更強(qiáng)，其中Ⅰ型膠原蛋白的主要功能是維持肌腱的機(jī)械性能[20]。Chai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，BMSC經(jīng)生長(zhǎng)分化因子(GDF)-6培養(yǎng)后其腱性標(biāo)志物scleraxis(SCX)和腱調(diào)蛋白(Tnmd)表達(dá)增加，可促進(jìn)大鼠的損傷髕腱再生。一項(xiàng)研究表明，GDF-7/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-12可在體外上調(diào)馬BMSC的核心蛋白聚糖(decorin)和Tnmd基因表達(dá)，證實(shí)其具有腱分化潛能[22]。有實(shí)驗(yàn)將經(jīng)BMP-12處理的BMSC移植到大鼠缺損跟腱處，發(fā)現(xiàn)SCX、Tnmd、Ⅰ型膠原蛋白和腱糖蛋白(tenascin)-C等腱細(xì)胞譜系相關(guān)基因表達(dá)增加[23]。

綜上所述，在肌腱損傷修復(fù)應(yīng)用中，BMSC可作為肌腱組織工程研究中的種子細(xì)胞來源，是肌腱組織工程研究的重點(diǎn)。與直接應(yīng)用生長(zhǎng)因子相比，經(jīng)過轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞可以穩(wěn)定地分泌相關(guān)生長(zhǎng)因子，是更具優(yōu)勢(shì)的促進(jìn)肌腱愈合的替代方式。

2.2 ADSC

Zuk等[24]研究發(fā)現(xiàn)，一種從脂肪組織中獲取的多能干細(xì)胞不但具有多向分化潛能，而且可表達(dá)與BMSC相似的標(biāo)志物，于是將其定義為ADSC。ADSC是成體MSC中的一種，廣泛分布于不同物種的脂肪組織中，并具有MSC這一類細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記[25]。與獲取骨髓、胚胎、臍帶等組織來源的干細(xì)胞不同，獲取ADSC具有微創(chuàng)性、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，且ADSC易向多譜系分化。但與BMSC相比，其在肌腱損傷愈合應(yīng)用中存在異位骨化[26]、基因突變等局限性。ADSC的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在來源廣泛、取材簡(jiǎn)單等方面，且脂肪基質(zhì)血管能提供遠(yuǎn)高于骨髓所能提供的干細(xì)胞數(shù)量。此外，ADSC可表達(dá)更多的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，并可改變Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的比值，從而促進(jìn)ECM重塑。有研究分析了BMSC、ADSC及TDSC等的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ADSCⅠ型膠原蛋白α2鏈(Col1A2)和Ⅲ型膠原蛋白α1鏈(Col3A1) 表達(dá)最高，其Col1A2/Col3A1比值也明顯高于其他組，而BMSC比值最低。上述研究均表明，在肌腱愈合過程中，ADSC在重塑ECM方面可能更具優(yōu)勢(shì)[27]。ADSC的應(yīng)用方式包括直接作用和聯(lián)合應(yīng)用，不同的應(yīng)用方式可影響ADSC促進(jìn)肌腱愈合的作用。

2.2.1 直接移植于肌腱損傷部位

有研究將ADSC直接注射至大鼠肌腱損傷模型損傷部位，發(fā)現(xiàn)ADSC在損傷部位可存在至少4周，并可分泌tenascin-C和人特異性Ⅰ型膠原蛋白[28]。該研究認(rèn)為，肌腱和韌帶組織的相對(duì)特異性標(biāo)志物是tenascin-C及SCX因子，其中tenascin-C能夠抑制β1整合素依賴的細(xì)胞黏附并可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的活性[29]。Shen等[30]將ADSC直接用于犬損傷模型的滑膜內(nèi)屈肌腱表面，發(fā)現(xiàn)ADSC可參與調(diào)控炎癥反應(yīng)，并可有效促進(jìn)肌腱修復(fù)。上述研究均表明，ADSC在肌腱損傷愈合中可以分化為肌腱組織并分泌相關(guān)的特異性標(biāo)志物。

2.2 復(fù)合富血小板血漿

Uysal等[31]利用ADSC聯(lián)合富血小板血漿(PRP)對(duì)兔損傷跟腱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，4周后發(fā)現(xiàn)ADSC聯(lián)合PRP組肌腱的最大抗張力負(fù)荷增加較對(duì)照組更明顯，其Ⅰ型膠原蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)均較對(duì)照組更高，但其TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3表達(dá)則均較低。

2.3 聯(lián)合水凝膠

已有研究證實(shí)，肌腱來源的水凝膠(tHG)可促進(jìn)大鼠急性跟腱損傷模型愈合[7]。tHG促進(jìn)肌腱愈合的作用機(jī)制包括：①可為受損肌腱提供ECM；②富含Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，可以模擬天然肌腱[32]。tHG經(jīng)ADSC及PRP優(yōu)化后，肌腱愈合可得到進(jìn)一步改善。研究顯示，在tHG聯(lián)合ADSC及成纖維細(xì)胞應(yīng)用時(shí)，tHG可上調(diào)一些肌腱細(xì)胞標(biāo)志物，從而創(chuàng)造出支持肌腱愈合的環(huán)境[33]。

3 TDSC

Bi等[34]首次從肌腱組織中獲取了一種具有干細(xì)胞普遍特性的細(xì)胞群，該細(xì)胞群在體內(nèi)可分化成肌腱組織，故可稱為TDSC。TDSC修復(fù)損傷肌腱的作用機(jī)制包括：①可作為肌腱組織工程中的種子細(xì)胞，將TDSC 直接用于損傷肌腱處可誘導(dǎo)其腱性分化，并可促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白和相關(guān)細(xì)胞因子分泌，從而恢復(fù)受損肌腱的功能；②在損傷肌腱處注入相應(yīng)的細(xì)胞因子可激活肌腱組織中的TDSC并促進(jìn)其增殖分化，從而達(dá)到修復(fù)受損肌腱的目的。Tian等[35]應(yīng)用自體TDSC治療大鼠損傷髕腱發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組肌腱膠原蛋白表達(dá)升高，組織結(jié)構(gòu)更加規(guī)則有序，且生物力學(xué)性能遠(yuǎn)優(yōu)于對(duì)照組。Shen等[36]在兔肩袖損傷模型中將TDSC接種在針織絲-膠原海綿支架中，發(fā)現(xiàn)TDSC可誘導(dǎo)肌腱分化并分泌抗炎細(xì)胞因子，從而抑制免疫排斥反應(yīng)，并促進(jìn)肩袖的再生。

3.1 TDSC的優(yōu)勢(shì)

TDSC的優(yōu)勢(shì)可表現(xiàn)為其較高的成腱性。TDSC與肌腱細(xì)胞類似，在肌腱修復(fù)中有很強(qiáng)的特異性，可以更好地適應(yīng)肌腱微環(huán)境而優(yōu)先分化成腱細(xì)胞。Bi等[34]研究發(fā)現(xiàn)，與小鼠BMSC相比，小鼠TDSC可表達(dá)更多的SCX、軟骨寡聚蛋白、SOX9和Runx2。有研究表明，在肌腱和韌帶組織的相對(duì)特異性標(biāo)志物中，SCX因子可介導(dǎo)肌肉在骨骼上附著，并可明顯促進(jìn)另一個(gè)腱性標(biāo)志物Tnmd表達(dá)[37]。因此，人TDSC的Tnmd表達(dá)水平可比人BMSC更高。Tan等[38]研究發(fā)現(xiàn)，TDSC可表達(dá)更多的Oct4，其增殖能力和克隆形成能力均優(yōu)于BMSC。有研究在比較TDSC與BMSC治療小鼠損傷跟腱的效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，TDSC組Ⅲ型膠原蛋白及其相關(guān)基因表達(dá)高于BMSC組，表明TDSC具有更高的再生潛能[2]。綜上所述，TDSC較BMSC在肌腱損傷愈合方面更具優(yōu)勢(shì)。

3.2 影響TDSC成腱性分化的因素

TDSC具有MSC的多向分化特性，包括成腱性、成骨性、成軟骨性及成脂性等[34]。其中，TDSC的成腱性在肌腱損傷愈合中有重要作用。TDSC作為種子細(xì)胞并聯(lián)合肌腱組織工程技術(shù)和細(xì)胞因子可誘導(dǎo)其向肌腱細(xì)胞分化，從而促進(jìn)肌腱的功能性愈合。Xu等[39]利用轉(zhuǎn)染BMP-12和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的TDSC治療大鼠損傷髕腱，發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)染的TDSC成腱相關(guān)基因被激活，但其成骨、成軟骨及成脂相關(guān)基因表達(dá)下降，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組肌腱組織結(jié)構(gòu)比對(duì)照組更規(guī)則、完整，且其最終破壞負(fù)荷更高。Lui等[40]用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和抗壞血酸對(duì)TDSC進(jìn)行處理并將處理后的TDSC應(yīng)用至大鼠肌腱缺損模型中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理的TDSC可通過smad1、smad5、smad8等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)肌腱相關(guān)蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)TDSC的成腱性分化，更利于肌腱功能性愈合。Zhang等[41]研究二甘聚糖對(duì)TDSC分化的影響，發(fā)現(xiàn)二甘聚糖調(diào)控TDSC成腱性分化的途徑為通過刺激BMP-7來增加smad1、smad5、smad8的磷酸化，經(jīng)低質(zhì)量濃度的二甘聚糖處理后，TDSC可表達(dá)更多的SCX、血小板反應(yīng)蛋白(THBS)-4及Tnmd等成腱性標(biāo)志物。

BMP-2、高糖、高膽固醇等均可抑制肌腱干細(xì)胞的成腱性分化。Rui等[42]研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2可抑制TDSC的成腱性分化，經(jīng)BMP-2刺激后，Dcn、Bgn及Fmod等TDSC成腱性標(biāo)志物表達(dá)減少。Shi等[43]在研究糖尿病小鼠的TDSC時(shí)發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境可促進(jìn)膠原糖基化，抑制ECM形成，下調(diào)Ⅰ型膠原蛋白和Tnmd等成腱性標(biāo)志物。Li等[44]研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇可下調(diào)TDSC成腱相關(guān)基因表達(dá)，Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、Tnmd、SCX等肌腱標(biāo)志物表達(dá)量與膽固醇濃度呈負(fù)相關(guān)。

4 結(jié)語(yǔ)

干細(xì)胞的應(yīng)用研究與技術(shù)發(fā)展對(duì)肌腱損傷治療具有十分重要的意義，因此受到廣泛關(guān)注。細(xì)胞因子與干細(xì)胞的應(yīng)用在肌腱損傷愈合中關(guān)系密切，但其具體作用機(jī)制還有待探索研究。BMSC、ADSC及TDSC均可分化為肌腱組織，但各自的分化途徑不同，特點(diǎn)也不同。BMSC作為肌腱組織工程中的種子細(xì)胞可廣泛應(yīng)用于研究中，但其存在異位骨化的可能，且修復(fù)后肌腱的生物力學(xué)強(qiáng)度尚不能達(dá)到健康肌腱的標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，如何在一定的時(shí)間窗使用一定濃度的基因轉(zhuǎn)染方式確保BMSC更多地定向分化為肌腱組織還需進(jìn)一步探索。ADSC獲得相關(guān)并發(fā)癥發(fā)病率低于BMSC，然而利用ADSC進(jìn)行肌腱修復(fù)和再生的動(dòng)物模型尚未得到充分研究，ADSC定向分化為肌腱組織及其相關(guān)因子的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。支架材料的研究和應(yīng)用是肌腱組織工程中的重要環(huán)節(jié)，以生物支架作為載體并用生長(zhǎng)因子做誘導(dǎo)可促進(jìn)ADSC腱性分化，將更好地發(fā)揮ADSC在肌腱損傷愈合中的作用。TDSC來源于肌腱組織，可以為肌腱愈合提供合適的微環(huán)境，但其調(diào)控因素很多，作用機(jī)制復(fù)雜，特性尚不明確，在很大程度上限制了其臨床應(yīng)用。同時(shí)，TDSC作為復(fù)雜的體內(nèi)干細(xì)胞，在體外擴(kuò)增后可能會(huì)發(fā)生表型漂移。在保持干細(xì)胞修復(fù)特性的前提下，開發(fā)大規(guī)模體外擴(kuò)增干細(xì)胞的技術(shù)是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。