張 晨,孫虹佳
(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,蘭州730000)
2020 年中國(guó)膿毒癥早期預(yù)防與阻斷急診專(zhuān)家共識(shí)指出膿毒癥(sepsis)是感染引起宿主反應(yīng)失調(diào),導(dǎo)致危及生命的器官功能損害癥候群,是一種高病死率的臨床綜合征[1]。膿毒癥是目前醫(yī)學(xué)界面臨的重大難題與挑戰(zhàn),盡管多年來(lái)臨床醫(yī)生對(duì)膿毒癥采用各種積極救治措施,但其發(fā)病率和死亡率仍居高不下。有研究表明近十年膿毒癥發(fā)生率為437/10 萬(wàn),病死率為17%;嚴(yán)重膿毒癥發(fā)生率為年270/10 萬(wàn),病死率為26%[2]。感染是膿毒癥發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ),大部分患者并發(fā)來(lái)自肺部、腹腔、泌尿道或皮膚黏膜的單一或混合菌的感染[3],其中以血流感染最為嚴(yán)重和危急。2017年美國(guó)重癥醫(yī)學(xué)會(huì)(SCCM)與歐洲重癥醫(yī)學(xué)會(huì)(ESICM)頒布的膿毒癥2016年指南推薦在膿毒癥診斷1 h 內(nèi)立即使用抗生素治療以殺滅病原菌控制患者病情,及時(shí)使用抗生素對(duì)于改善預(yù)后具有重要意義[4]。目前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍是血培養(yǎng),但是血培養(yǎng)需時(shí)長(zhǎng),培養(yǎng)及鑒定通常需要3~5 天的時(shí)間,且膿毒癥患者早期癥狀多不明顯,病情進(jìn)展迅速,極易錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間。因此,臨床迫切需要能夠快速、準(zhǔn)確診斷早期膿毒癥的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)以指導(dǎo)臨床抗生素治療。
有研究表明,細(xì)菌進(jìn)入血液循環(huán)后能分泌具有明顯促炎活性的代謝產(chǎn)物,引起多種炎性介質(zhì)的分泌、合成及釋放。這些產(chǎn)物的釋放可以進(jìn)一步加重免疫細(xì)胞的耗竭,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)崩潰,導(dǎo)致個(gè)別介質(zhì)的升高或降低。除此之外,還會(huì)通過(guò)中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞生成的自由基來(lái)激活氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]。因此,膿毒癥病程中部分炎性介質(zhì)和氧化應(yīng)激介質(zhì)會(huì)不同程度的增高或降低,即可作為早期膿毒癥的診斷指標(biāo)[6],如血清降鈣素原(PCT)、可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1(sTREM-1)、肝素結(jié)合蛋白(HBP)、丙二醛(MDA)、高級(jí)氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)、氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等,且隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展,分子生物學(xué)直接鑒定病原菌也是目前研究的方向和重點(diǎn)[7]。本文就上述指標(biāo)及方法在急診膿毒癥早期診斷中的研究進(jìn)展綜述如下。
PCT 是在細(xì)菌內(nèi)毒素刺激下由多種實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的降鈣素前體,由116個(gè)氨基酸組成,是一種無(wú)激素活性的糖蛋白,也是臨床常用的炎性指標(biāo)[8]。20 世紀(jì)80年代,有研究者在研究急性肺損傷(acute lung injury,ALI)標(biāo)志物時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)膿毒癥及感染性休克患者多伴有血清降鈣素原(PCT)明顯升高,人們猜測(cè)PCT 與感染之間存在一定聯(lián)系。1993年,法國(guó)學(xué)者Asscot 首次發(fā)現(xiàn)PCT 可在嚴(yán)重細(xì)菌感染時(shí)出現(xiàn)顯著升高[9],機(jī)體受到細(xì)菌感染2~4 h 后PCT 水平開(kāi)始升高,8~24 h 達(dá)到高峰,可持續(xù)數(shù)天至數(shù)周。已有研究表明,血流感染時(shí)血清中PCT 濃度與患者病情嚴(yán)重程度可呈正相關(guān)。當(dāng)PCT 為0.1~0.25ng/ml 時(shí),提示細(xì)菌感染的可能性較小,PCT 為0.25~0.5ng/ml 時(shí),可能存在需要治療的細(xì)菌感染,當(dāng)濃度大于0.5ng/ml 時(shí),患者有發(fā)展成嚴(yán)重膿毒癥甚至膿毒性休克的風(fēng)險(xiǎn),而當(dāng)PCT 濃度達(dá)1.0ng/ml 時(shí),其診斷膿毒癥的敏感度為80.3%,特異度為72.2%[10]。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)PCT 水平可用于鑒別診斷膿毒癥與其它全身炎癥反應(yīng)綜合征及評(píng)估膿毒癥的嚴(yán)重程度[11]。由于PCT能夠快速、靈敏地反映機(jī)體炎癥變化情況,近年來(lái)已作為一種較為敏感的炎癥標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。
細(xì)菌性感染中又以革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌感染最為多見(jiàn),但兩種類(lèi)型的病原菌致病能力不同,細(xì)菌對(duì)宿主感染致病能力取決于其侵襲力、毒素、體內(nèi)誘生抗原和超抗原等毒力的大小[12]不同,兩種類(lèi)型血流感染的抗菌治療方案選擇也截然不同,因此在早期診斷膿毒癥的同時(shí)區(qū)分細(xì)菌感染類(lèi)型也尤為重要。已有研究者發(fā)現(xiàn)革蘭陰性組的血清PCT水平入院后24 h,3天、7天均高于革蘭陽(yáng)性組[13],這是由于革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌細(xì)胞膜的主要成分不同,革蘭陽(yáng)性菌主要膜成分是肽聚糖(PGN),而革蘭陰性菌的主要膜成分是脂多糖(LPS),在先天免疫應(yīng)答中模式識(shí)別受體(PRRs)可以識(shí)別LPS 和PGN 作為病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs),并啟動(dòng)不同信號(hào)通路誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放[14]。
近年來(lái)真菌感染引發(fā)膿毒癥的發(fā)病率及死亡率呈明顯上升趨勢(shì),其中非白色念珠菌屬引起的侵襲性真菌感染有增多的趨勢(shì),已有研究發(fā)現(xiàn)PCT 在真菌血流感染組和局部真菌感染組均高于對(duì)照組,并與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),提示PCT 在診斷早期真菌性膿毒癥方面也有一定的參考價(jià)值[15]。
sTREM-1 是免疫球蛋白超家族TREM-1 的可溶性形式,也稱(chēng)為可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體,是髓細(xì)胞表面表達(dá)的免疫球蛋白,能夠激活多種髓樣細(xì)胞并啟動(dòng)炎癥反應(yīng),其在非感染性炎癥疾病中存在極低[16]。在感染發(fā)生時(shí),sTREM-1 大量分泌并釋放入血或其他體液中,可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫粒、驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1(MIP-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)等促炎因子的釋放,并可以促進(jìn)患者體內(nèi)下游IL-6 或者IL-10 等細(xì)胞炎癥因子改變并加重單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞對(duì)于膿毒癥患者重要內(nèi)臟器官的損傷[17]。
臨床研究發(fā)現(xiàn),sTREM-1水平在膿毒癥患者的血清中明顯高于對(duì)照組,提示sTREM-1在感染性疾病的診斷中具有高度的靈敏度和特異度[18]。也有研究發(fā)現(xiàn),sTREM-1 對(duì)于兒童膿毒癥的早期診斷也有臨床意義,研究中新生兒膿毒癥組sTREM-1平均水平明顯高于對(duì)照組,sTREM-1 區(qū)分截點(diǎn)為69.8ng/L,敏感度為96.7%,特異度為86.7%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為83.9%和92.9%[19]。
HBP 主要存在于中性粒細(xì)胞的分泌顆粒和嗜天青顆粒中,又稱(chēng)為天青殺素。HBP 可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,并對(duì)單核/巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生趨化作用,釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和γ-干擾素(IFN-γ),通過(guò)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)形成“炎性因子風(fēng)暴效應(yīng)”[20]。健康人血液中HBP含量較低,當(dāng)細(xì)菌及其毒素侵入血液循環(huán)中,中性粒細(xì)胞被大量激活并釋放HBP,血液中其含量升高。有研究表明HBP 在膿毒癥早期72 h 內(nèi)就顯著升高,并存在較寬的窗口期,對(duì)膿毒癥有很好的診斷效能,適合作為膿毒癥早期預(yù)測(cè)指標(biāo)[21]。還有研究對(duì)比了膿毒癥患者治療前后的肝素結(jié)合蛋白檢測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)治療后HBP 較治療前降低,提示患者的治療有效。研究結(jié)果還顯示,治療后大部分嚴(yán)重膿毒癥與膿毒癥休克患者的病情得到控制,分級(jí)轉(zhuǎn)為一般膿毒癥[22]。
4.1 丙二醛(MDA)和高級(jí)氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)MDA 和AOPPs 是細(xì)胞中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等與自由基氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。當(dāng)機(jī)體發(fā)生膿毒癥時(shí),體內(nèi)大量炎性因子進(jìn)入到血液循環(huán)中,氧化應(yīng)激過(guò)程加劇,促使氧代謝產(chǎn)物MDA,AOPPs 等過(guò)度生成,其中MDA 是氧自由基損傷脂質(zhì)后再與細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)后生成的產(chǎn)物,可以間接反映膿毒癥患者的氧化損傷程度[23]。而AOPPs 是由脂質(zhì)氧化而成,其體內(nèi)濃度可以有效地反映組織細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度。總之,MDA 和AOPPs 的檢測(cè)可以反映一段時(shí)間內(nèi)患者體內(nèi)的氧自由基含量,如果兩者生成增多則說(shuō)明氧化應(yīng)激反應(yīng)被激活,細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到自由基的攻擊增多[24]。
4.2 超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)SOD和CAT 是體內(nèi)具有抗氧化作用的催化酶。膿毒癥時(shí),激活的炎癥細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)(ROS),體內(nèi)大量聚集的ROS 導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。而SOD 是抗氧化劑,能將自由基還原為過(guò)氧化氫,特異性清除體內(nèi)的ROS,減輕自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷程度,此時(shí)體內(nèi)的SOD 被大量消耗,已有研究表明SOD 的濃度可以有效地反映出機(jī)體抵抗酶類(lèi)氧化的能力[25],同時(shí)其濃度的降低程度與器官的受損程度相關(guān)[26]。CAT 是過(guò)氧化氫酶,能使體內(nèi)的過(guò)氧化氫還原為水,與SOD 共同作用使自由基被還原并清除[27]。
也有研究表明革蘭陰性菌感染患者血清中氧化應(yīng)激介質(zhì)的升高或降低較革蘭陽(yáng)性菌感染患者更為顯著[28],但其在血清中的含量能否區(qū)別革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌感染仍是目前的研究趨勢(shì)。
對(duì)于細(xì)菌引起的膿毒癥,快速準(zhǔn)確地鑒定病原菌是診斷和治療的根本。隨著分子生物學(xué)和基因診斷技術(shù)的發(fā)展,分子生物學(xué)檢測(cè)也為膿毒癥的早期診斷提供了新的思路。相對(duì)于生化反應(yīng)而言病原菌的基因組更穩(wěn)定,通過(guò)基因擴(kuò)增及其后續(xù)技術(shù)可準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出病原菌。
5.1 16S 核糖體核糖核酸( 16S ribosomal Ribonucleic Acid,16S rRNA) 16S rRNA 基因是細(xì)菌染色體中編碼為16S rRNA 的對(duì)應(yīng)DNA 序列,是細(xì)菌等原核生物特有的RNA[29],具有高度的保守性,不同種屬細(xì)菌的16S rRNA 基因同源性較高,能夠達(dá)到90%以上,在細(xì)菌鑒定中發(fā)揮著重要的作用[30]。通過(guò)16S rRNA的基因PCR擴(kuò)增,進(jìn)而對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分析,便能夠?qū)Ω腥镜牟≡M(jìn)行早期判斷。有研究者對(duì)80例疑似膿毒癥患者血培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果與16S rRNA 的PCR 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)得出后者的陽(yáng)性率為41.25% ,明顯高于血液標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果,表明PCR 檢測(cè)16S rRNA 基因在鑒別細(xì)菌感染疾病方面具有較高的陽(yáng)性率,且受抗生素的影響較小[31]。但由于某些細(xì)菌種間差異較小,16S rRNA 基因的分辨力有限。
5.2 16S~23S 核糖體核糖核酸 ( 16S~23S Ribosomal Ribonucleic Acid,16S~23S rRNA) 現(xiàn)有研究者通過(guò)16S~23S rRNA 基因進(jìn)行病原菌的鑒定,16S~23S rRNA 基因是位于16S rRNA基因與23S rRNA基因之間的區(qū)間序列,具有高度變異及相對(duì)保守性,不同種屬細(xì)菌16S~23S rRNA 區(qū)間的拷貝數(shù)、長(zhǎng)度和堿基序列存在差異,具有種特異性,因此可用于細(xì)菌菌種間的鑒別,可作為很好的分子靶標(biāo)[32]。但有研究者通過(guò)對(duì)16S rRNA 的研究得出結(jié)論,在血流感染時(shí),病原菌的拷貝數(shù)并不高,無(wú)法直接分析患者血液標(biāo)本中的rRNA 基因,仍需要將血培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行純培養(yǎng)后進(jìn)行分析,所以此種方法能否在膿毒癥早期即鑒定出病原菌以指導(dǎo)臨床抗生素應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究[33]。
綜上所述,急診膿毒癥患者病情危急、死亡率高,進(jìn)行早期診斷及合理抗生素治療對(duì)于提高患者生存率及改善預(yù)后有極大的意義,必須給予高度重視。上述血清炎性介質(zhì)、氧化應(yīng)激介質(zhì)及分子生物學(xué)方法在膿毒癥早期的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展及預(yù)后評(píng)估中都具有重要的診斷價(jià)值,臨床醫(yī)生可選擇某一指標(biāo)或多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)膿毒癥進(jìn)行早期診斷。但由于革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌所致膿毒癥抗生素治療方案不同,仍需通過(guò)大量研究找到其水平能夠明確區(qū)分病原菌類(lèi)型的生物介質(zhì),或者找到介質(zhì)水平變化能夠?qū)χ委熢\斷及預(yù)后評(píng)價(jià)進(jìn)行指導(dǎo)的生物介質(zhì)。此外,16S~23S rRNA 基因的檢測(cè)能夠準(zhǔn)確鑒定出病原菌,但是由于檢測(cè)成本、檢驗(yàn)時(shí)限等原因尚未大量應(yīng)用于臨床,如果能夠提高檢測(cè)技術(shù)水平,直接對(duì)患者血清標(biāo)本進(jìn)行鑒定,則可以縮短24~48 h的細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間,極大程度地為臨床提供治療依據(jù),指導(dǎo)抗菌藥物治療。
現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2021年1期