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貉細小病毒性腸炎研究進展

2021-12-02 15:24郭曉芹趙傳芳胡博呂爽白雪張蕾張海玲呂甜甜曹海旭于小亞
特產(chǎn)研究 2021年3期
關(guān)鍵詞:細小疫苗蛋白

郭曉芹,趙傳芳※,胡博,呂爽,白雪,張蕾,張海玲,呂甜甜,曹海旭,于小亞

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,吉林 長春 130112;2.吉林省科技創(chuàng)新平臺管理中心,吉林 長春 130012)

目前,對貉子的研究,國內(nèi)集中于預(yù)防檢疫(流感病毒的預(yù)防檢疫[1]、圓環(huán)病毒的檢測[2]、新孢子蟲和弓形蟲血清陽性率的篩選[3,4])與遺傳機制(如染色體對比的親緣關(guān)系比較[5]、微衛(wèi)星標(biāo)記的鑒定發(fā)展[6]、基因的克隆鑒定[7]、基因多態(tài)性的比較[8]和線粒體基因組的拼接[9])等方面。而國外(如歐洲)的貉子大抵都是從東亞地區(qū)引進,作為主要的毛皮動物,偏重研究貉群體結(jié)構(gòu)和遺傳特性,而對育種方面的研究較少,所以我們可以在這方面多加關(guān)注,使我國占領(lǐng)貉子養(yǎng)殖的領(lǐng)先地位[10]。貉細小病毒性腸炎是一種急性、高度接觸性傳染病,幼貉患病后死亡率達90%以上[11],給貉的養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn),貉細小病毒腸炎近年來在我國的發(fā)病率呈上升趨勢。2013-2018年間,在齊魯動物保健品有限公司所檢測的毛皮動物腸炎病例中有91.4%是貉細小病毒腸炎[12]。

1 病原學(xué)

1.1 生物學(xué)特性

貉細小病毒(RDPV)是肉食動物細小病毒的一種,能夠自我復(fù)制,在其5.3 kb的單鏈DNA基因組中有兩個轉(zhuǎn)錄單位,基因組的兩端存在有利于DNA復(fù)制的回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)[13]?;蚪M中右側(cè)單位產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2,并形成26 nm二十面體衣殼[14],非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2從基因組左側(cè)轉(zhuǎn)錄單位表達。其中VP2是細小病毒的主要衣殼蛋白(約90%),決定病毒的抗原特性、宿主范圍、血凝性及介導(dǎo)病毒粒子對宿主細胞感染的能力[15]。多項研究表明,VP2蛋白第300位氨基酸是調(diào)控宿主范圍的重要位點。一項研究中將貓細小病毒(FPV)的VP2蛋白300處從Asp突變?yōu)镠is后會使FPV變得更易于與貓TfR受體結(jié)合[15];而在一項針對浣熊細小病毒(RPV)的研究中發(fā)現(xiàn)將VP2蛋白300處由Asp(GAT)轉(zhuǎn)變?yōu)镚ly(GGT)/Val(GTT)后,RPV就可以感染犬細胞(正常RPV是不會感染犬的)且通過體外實驗證明VP2蛋白300位氨基酸的改變可使犬、貓、雪貂和貂的細胞均受到感染[16,17]。值得注意的是,病毒入侵宿主機體是一個極為復(fù)雜的過程,因此,細小病毒中VP2蛋白的300位氨基酸調(diào)控宿主范圍還需進一步的動物試驗來證實其準(zhǔn)確性[18]。NS1是一種核磷酸蛋白,主要參與RDPV的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及病毒對宿主的致病性[19,20]。

1.2 理化特性

RDPV能夠凝集不同哺乳動物(如恒河猴、豬及馬等)和鳥類的紅細胞且血凝反應(yīng)可被特異性抗體抑制。在RDPV血凝實驗中緩沖液的pH值對其血凝效價影響不大[21]。RDPV對外界的抵抗力很強,耐酸和耐熱性好,乙醇、氯仿及胰酶等大多數(shù)消毒劑都不能使其滅活。病毒粒子可被福爾馬林、次氯酸鈉、-丙內(nèi)酯、羥胺、氧化劑和紫外線照射滅活[22]。

1.3 RDPV的遺傳與進化

RDPV與 細小病毒(CPV)、FPV、水貂腸炎病毒(MEV)、RPV和藍狐細小病毒(BFPV)都源于一個共同祖先。1900年FPV首先被發(fā)現(xiàn),隨后出現(xiàn)FEV、MEV等,1978年CPV以CPV-2型首次在犬體中被發(fā)現(xiàn)。之后隨著VP2蛋白變異不斷涌現(xiàn)出CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c,New CPV-2a、New CPV-2b等新基因型,其中CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c既可感染犬又可感染貓[23,24]。根據(jù)相關(guān)文獻得知,RDPV自1984年(首次在我國黑龍江省發(fā)生)至今所分離出的毒株雖然都屬于CPV-2亞型,但從2016年開始,RDPV主要衣殼蛋白VP2上的多個氨基酸殘基發(fā)生了非同義性突變,包括S27T、S297A和I418T,這被稱為新型CPV-2,可能是細小病毒進化的過渡階段[25-27]。

2 流行病學(xué)

每年的6~10月份,該病主要是患病貉或者耐病貉的糞、尿和唾液經(jīng)過消化道和呼吸道傳染給免疫前后的幼貉(7~9周齡),幼貉的發(fā)病率大于70%,死亡率高達90%,成年貉發(fā)病率和死亡率均在20%左右,多呈慢性和隱性感染,成為最危險的傳染源[21]。

3 臨床癥狀及病理變化

本病的潛伏期為5 d左右,病程一般為4~14 d,15 d后多轉(zhuǎn)為亞急性或慢性經(jīng)過?;疾『殉霈F(xiàn)精神萎靡、被毛凌亂無光澤、腹瀉(腹瀉糞便上附有黏液,呈灰白色管柱狀物,嚴(yán)重的會出現(xiàn)番茄樣血便)、體溫升高且白細胞明顯急劇減少等癥狀[28],在病死貉的胃腸道內(nèi)均有出血現(xiàn)象。腸黏膜(尤其是十二指腸)有壞死和纖維素性偽膜,腸系膜淋巴結(jié)細胞減少,網(wǎng)狀細胞增多,腸絨毛斷裂,腸道固有層炎性細胞浸潤。腸系膜淋巴結(jié)和脾臟腫大、充血,脾臟可見淋巴細胞減少[29]。

4 致病機理

細小病毒基因組不能編碼DNA聚合酶,所以僅能在分裂細胞的細胞核復(fù)制,這決定了其對感染靶點的選擇即那些大量存在有絲分裂細胞的組織和器官,如新生組織、淋巴系統(tǒng)和腸上皮細胞等。細小病毒感染是系統(tǒng)性感染包括各種組織和器官系統(tǒng),細小病毒經(jīng)消化道或者呼吸道首先在感染動物的咽上皮(扁桃體、淋巴結(jié))上復(fù)制,之后進入血液循環(huán)產(chǎn)生病毒血癥,進而傳播到淋巴器官和骨髓上造成淋巴細胞和骨髓增殖細胞的壞死,導(dǎo)致淋巴細胞減少,從而出現(xiàn)泛白細胞減少癥。在這之后病毒復(fù)制增殖到高度分裂的腸隱窩細胞,導(dǎo)致腸腺的上皮細胞死亡使上皮脫落、絨毛變短,最終表現(xiàn)出本病的典型臨床癥狀——嘔吐和腹瀉[30]。但是,胎兒或新生動物感染疾病特征有所不同,F(xiàn)PV感染幼貓可以導(dǎo)致共濟失調(diào)并發(fā)癥,病毒感染小腦,導(dǎo)致小腦的發(fā)育不全[31]。

5 檢測技術(shù)

5.1 病原學(xué)、血清學(xué)檢測

如果具備新鮮豬血,選擇血凝試驗(HA)和血凝抑制(HI)實驗可在幾小時內(nèi)得到結(jié)果;假如檢測的時間足夠,可以選擇常規(guī)的病原學(xué)的病毒分離鑒定和血清中和試驗(SN),只要具備相應(yīng)的條件,這些病原學(xué)及血清學(xué)的檢測方法依舊不失為經(jīng)典。

5.2 分子生物學(xué)檢測

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,細小病毒的分子生物學(xué)檢測方法相應(yīng)增多。目前,應(yīng)用比較成熟的技術(shù)包括常規(guī)PCR法(擴增特異DNA片段)、間接免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等,這幾種檢測技術(shù)操作簡便,高效靈敏,相對來說比較常用。

實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)靈敏性高,穩(wěn)定性強,對于檢測20~30份樣品,qPCR所用的時間僅是傳統(tǒng)PCR所用時間的1/2[32]。實時PCR可根據(jù)基因保守區(qū)設(shè)計特異性引物和TaqMan探針,再建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,可用于定量檢測病毒,還有研究人員采用qPCR測定了CPV的抗原型,成功地將qPCR應(yīng)用于病毒的分型鑒定上[33]。

核酸探針檢測技術(shù):利用熒光生物素標(biāo)記核酸,通過熒光觀察檢測病原,具有較高的靈敏性和準(zhǔn)確性。值得一提的是,有研究人員利用小溝結(jié)合(MGB)探針測定法成功地區(qū)別檢測了CPV-2型疫苗和CPV野外毒株,給接種CPV疫苗后患病犬的檢測帶來了福音[34]。

LAMP是一種體外等溫擴增特異核酸片段技術(shù),目前在多個細小病毒屬鵝細小病毒(GPV)、CPV、老鼠細小病毒(MPV)、牛細小病毒(BPV)和FPV等中都得到了應(yīng)用[35]。根據(jù)已建立起的這些方法來看,LAMP最大的優(yōu)點在于能夠簡單地進行現(xiàn)場檢測,有研究建立的檢測CPV的LAMP方法,制備簡單的模板后可以直接在疑似患病犬的糞便樣品中檢測CPV,方便快捷[36]。而根據(jù)建立的檢測GPV的LAMP方法,反應(yīng)條件只是需要65℃的水浴,20 min后就能得到結(jié)果[37]。

重組酶聚合酶擴增(RPA):通過與側(cè)流層析試紙條、生物芯片及凝膠電泳等多種方法相結(jié)合的方式進行檢測的核酸恒溫擴增技術(shù)。已經(jīng)有針對犬細小病毒2型(CPV-2)建立的RPA技術(shù)檢測方法,反應(yīng)只需在水浴中進行,和LAMP檢測方法一樣,可用于現(xiàn)場或者野外條件下的CPV檢測[38]。

6 疫苗防控

現(xiàn)在我國仍利用CPV-2和MEV-B型疫苗對貉細小病毒性腸炎進行防控。隨著對細小病毒研究的不斷深入,針對其制備的疫苗也越來越多。目前主要包括3類,即傳統(tǒng)疫苗、基因工程苗和病毒樣顆粒疫苗。

傳統(tǒng)疫苗包括滅活苗和弱毒苗。滅活疫苗(Inactivated Vaccine)主要誘導(dǎo)體液免疫,雖然安全,但誘導(dǎo)動物產(chǎn)生的抗體水平持續(xù)時間短,免疫原性不理想,多次免疫效果顯著。弱毒疫苗(Attenuated Vaccine)有良好的免疫原性,是目前使用頻率最高的。但是弱毒疫苗能致使毒力返祖,而且對于變異毒株的保護率較低,所以在研制弱毒疫苗時,應(yīng)該廣泛開展細小病毒病的流行病學(xué)調(diào)查,篩選疫苗保護率高的候選株,同時加強對疫苗臨床使用后抗體的監(jiān)測。

基因工程疫苗包括重組活載體疫苗、基因疫苗和亞單位疫苗等。重組活載體疫苗(Recombinant Live Vector Vaccine)是利用基因工程技術(shù)將抗原基因重組到其他無致病性的病毒或細菌的基因組內(nèi),使動物機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。該疫苗能刺激動物機體產(chǎn)生B細胞、T細胞免疫以及黏膜免疫?;钶d體疫苗是新型疫苗的代表,表現(xiàn)在其免疫效果好、經(jīng)濟和可操作性強,并且可以構(gòu)建聯(lián)苗,便于大規(guī)模制備[39]。基因疫苗(Gene Vaccine)又稱DNA疫苗,細小病毒的基因疫苗是利用基因工程技術(shù)將VP2或VP1蛋白抗原基因克隆到真核表達載體,注入動物體內(nèi),使外源基因在動物體內(nèi)表達,產(chǎn)生B細胞免疫和T細胞免疫。根據(jù)相關(guān)研究表明,利用VP1、VP2構(gòu)建的真核表達質(zhì)??沙晒φT導(dǎo)動物機體產(chǎn)生免疫反應(yīng),保護動物免受病毒的攻擊。但是外源基因在體內(nèi)長期存在可能會產(chǎn)生遺傳毒性或者整合到宿主染色體從而引起突變[40]。針對問題所在,自殺性DNA疫苗應(yīng)運而生,不僅可產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答,而且能使插入的外源基因凋亡,不會引起機體DNA的改變[41]。亞單位疫苗(Subunit Vaccine)是將病毒的保護性抗原基因與真核或原核表達載體進行重組表達,然后將重組的重組蛋白處理后添加一定量的佐劑制備而成。目前對于亞單位疫苗的研究處于基礎(chǔ)水平,主要是由于技術(shù)不夠成熟,免疫后抗體水平不理想。由于亞單位疫苗不含有病毒的核酸,因此安全性很高,未來有很大的研究價值。

病毒樣顆粒(VLPs)疫苗是利用病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白組裝成空心顆粒,它雖在形態(tài)上與病毒相似,但由于其是不含病毒的核酸,因此不能進行自我復(fù)制,所以安全性比較好。肉食動物細小病毒VLPs的制備一般是利用病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2進行真核或者原核表達后組裝獲得。據(jù)目前報道,在昆蟲細胞[42-44]、大腸桿菌[45]、畢赤酵母[46]以及馬克斯克魯維酵母中[47]表達的VP2蛋白都能夠自組裝成VLPs,且制備的疫苗具有較高的免疫原性。羅國良等[48]將貉細小病毒基因RDPVVP2-OPTI與昆蟲表達載體pFastBac1連接然后轉(zhuǎn)化到桿狀病毒DH10 Bac E.coli中經(jīng)培養(yǎng)獲得表達貉細小病毒RDPV-VP2蛋白的重組桿狀病毒,然后轉(zhuǎn)染SF21細胞,培養(yǎng)至細胞出現(xiàn)感染后收集細胞病毒液制備疫苗,實驗證明此疫苗對貉細小病毒有良好的免疫效果和預(yù)防效果。對于目前來說,肉食動物細小病毒VLPs的獲得率比較低,所以開發(fā)出一種高效的表達體系,提高其獲得率從而將病毒樣顆粒疫苗推向臨床應(yīng)用是未來VLPs疫苗的新走向[49]。

7 展望

貉子養(yǎng)殖在我國已經(jīng)有40年之久,雖然養(yǎng)殖技術(shù)越來越成熟,養(yǎng)殖環(huán)境得以改善,但是由于細小病毒的不斷變異,給貉病毒性腸炎的防控增加了新難題。未來對于貉細小病毒的防控需要我們進行流行病學(xué)調(diào)查,及時了解RDPV的進化、變異和發(fā)展趨勢,這樣才能針對變異毒株,制備更加有效的疫苗。另外,2020年新冠病毒(SARS-CoV-2)暴發(fā),在養(yǎng)殖水貂中快速傳播并使其發(fā)生變異,變異后的毒株被證實能同時感染水貂和人[50]。而同樣作為毛皮獸的貉子是否能被SARSCoV-2感染也應(yīng)有相應(yīng)流行病學(xué)調(diào)查進行跟蹤,為人類和動物創(chuàng)造一個安全的生活環(huán)境。

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