劉琳玲，宋姍姍，宋興超，王桂武※，張如，叢波

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特種經(jīng)濟動物遺傳育種與繁殖重點實驗室；吉林省特種經(jīng)濟生物學省部共建國家重點實驗室，吉林 長春 130112；2.銅仁學院，貴州 銅仁 554300）

FAO曾預測，21世紀80%的生物育種將依賴分子育種[1]。當前，分子標記輔助選擇（marker assisted selection,MAS）是最主要的動物分子育種手段，通過找到與目標性狀相關(guān)基因緊密連鎖的分子標記，分析其基因型，進而對該物種相關(guān)性狀進行遺傳改良[2]。分子輔助育種可以高效篩查與質(zhì)量性狀相關(guān)的基因組區(qū)域（quantitative trait locus,QTL），采用多態(tài)DNA標記繪制遺傳圖譜，如微衛(wèi)星和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism,SNP）[3]，篩查得到的變異位點，將其與個體質(zhì)量性狀進行關(guān)聯(lián)分析，得到的結(jié)果可以加速育種進程，使優(yōu)良個體被快速識別[4]。

水貂是極其珍貴的毛皮動物，被毛顏色是其貂皮價值最重要的指標。宋興超[5]對黑色、白色和灰色被毛表型的水貂皮膚樣本進行轉(zhuǎn)錄組序列測定，結(jié)果找到17個參與水貂被毛色素沉積過程的差異表達基因。動物毛色主要由真黑色素與褐黑色素的合成比例、數(shù)量及其在毛皮質(zhì)和髓質(zhì)中沉積的種類與數(shù)量不同所決定且由這些基因共同調(diào)控[6]。

水貂皮被稱為“裘皮之王”，其特點是絨毛非常豐厚且輕柔結(jié)實[7]。目前，對于水貂毛絨品質(zhì)的性能測定主要有兩種方式，一種是皮張分等與分級；另一種是活體打分。皮張的分等與分級是指送到拍賣行，依據(jù)已定的質(zhì)量標準進行等級分類，根據(jù)皮張外部質(zhì)量和特點歸類。活體的性能測定主要包括體長、清晰度、光澤度、毛密度、針毛覆蓋率和整體毛絨質(zhì)量。在水貂育種中，與活體毛皮等級及干皮品質(zhì)相關(guān)的性狀均處于強選擇狀態(tài)[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)這些毛絨品質(zhì)相關(guān)性狀的遺傳力為0.06～0.30[8]。另一項研究報道了這些相關(guān)性狀的遺傳力為0.15～0.43[9]，由于水貂毛絨品質(zhì)相關(guān)性狀的遺傳選擇力較大，即變異系數(shù)較大，因此可以通過個體選育進行選擇。在傳統(tǒng)的水貂養(yǎng)殖過程中，生產(chǎn)群體的親本是根據(jù)毛皮質(zhì)量來選擇的，而經(jīng)濟回報的多少則取決于干皮品質(zhì)的高低[8]。因此，有必要對活體動物的性狀（如體重和體長）和毛皮品質(zhì)性狀進行研究。本研究綜述分子育種技術(shù)在水貂毛絨品質(zhì)性狀相關(guān)基因中的應用，以期為進一步加快高毛絨品質(zhì)的優(yōu)良水貂品種的選育提供理論依據(jù)。

1 分子育種技術(shù)在水貂毛色性狀相關(guān)基因中的應用

動物被毛顏色已成為一種重要的育種性狀。1931年首次報道水貂毛色突變體，其為孟德爾常染色體隱性遺傳，特征毛皮顏色為銀藍色[10，11]。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)與被毛顏色相關(guān)的功能基因，包括黑素皮質(zhì)激素受體-1（melanocortin 1 receptor,MC1R）基因、酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）基因、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（tyrosinase-related protein 1,TYRP1）基因、刺鼠信號蛋白（agouti signaling protein,ASIP）基因、黑素親和素（melanophilin,MLPH）基因和小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia associtated transcription factor,MITF）基因。

MC1R是G蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein-coupled receptor,GPCR）家族最小的受體，在色素合成過程中起開關(guān)作用，能與-黑色素細胞刺激素（-MSH）結(jié)合，最終活化酪氨酸激酶[12，13]，通過調(diào)控真黑色素與褐黑色素的濃度比例，使動物毛色分別表現(xiàn)出黑色、棕色、紅色和黃色[10]。宋興超[5]采用PCR擴增和Sanger測序技術(shù)檢測水貂MC1R基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)SNPs，發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)上游存在1個缺失突變g.132_135 delAGTG，其突變基因型在金州黑水貂、吉林白水貂、銀藍水貂和咖啡水貂4種毛色群體中差異極顯著（P＜0.0001）。推測該位點可能與水貂毛色表型具有相關(guān)性，其中銀藍水貂中突變雜合體的基因型頻率最高，說明該突變位點可能影響銀藍水貂被毛顏色的主控位點。

TYR蛋白由調(diào)控白化位點（Albino）的酪氨酸酶基因編碼，它在動物體黑色素合成過程中起關(guān)鍵作用，其表達量和活性直接影響黑色素生成的速度和產(chǎn)量，因此該基因的變異可影響動物毛色性狀[14,15]。Anistoroaei等[16]推斷，在TYR基因的外顯子1中發(fā)現(xiàn)一處無義突變（138TGT→TGA），可能與丹麥水貂白化表型的產(chǎn)生具有相關(guān)性；Benkel等[17]在TYR基因外顯子4中發(fā)現(xiàn)1個SNPs，c.1835C＞G位點與喜馬拉雅水貂被毛的大理石花紋形成相關(guān)；Blaszczyk等[18]研究發(fā)現(xiàn)TYR基因外顯子1的一處無義突變使編碼半胱氨酸的密碼子TGT變?yōu)榻K止子TGA，這一變異與美洲水貂白化相關(guān)。邢思遠[19]采用Sanger直接測序法在紅眼白水貂、美國短毛黑水貂和銀藍水貂TYR外顯子1中發(fā)現(xiàn)1個變異位點，c.78A＞T顛換與白色水貂毛色差異極顯著（P＜0.001)，TYR基因外顯子1中有1個SNPs（g.138TA）為無義突變，與吉林白水貂表型相關(guān)。這幾項研究結(jié)果一致，得出該基因的突變與水貂毛色的白化相關(guān)。宋興超等[20]采用PCRRFLP技術(shù)篩查不同被毛色型水貂T138A位點多態(tài)性并進行分析，結(jié)果表明該位點在5種毛色品種水貂中存在T和A這2個等位基因，可形成3種基因型：TT、TA和AA。其中吉林白水貂T138A位點AA基因型頻率最高，而在具有黑色被毛金州黑水貂群體中未檢測到該SNP位點。綜上，TYR基因的138TGT→TGA、c.78A＞T、T138A和外顯子4序列缺失這些變異可作為水貂白色表型育種的遺傳標記。

美洲水貂TYRP1基因由7個外顯子組成，全長編碼序列為1.6 kb，編碼537個氨基酸，形成不穩(wěn)定的親水蛋白質(zhì)[21]，該蛋白通過調(diào)節(jié)酪氨酸酶的活性，影響黑色素小體結(jié)構(gòu)和黑色素細胞的增殖與凋亡以及黑色素的合成[22]。Berryere等[23]研究發(fā)現(xiàn)褐色表型是由TYRP1基因的突變產(chǎn)生的。Kenny等[24]研究發(fā)現(xiàn)TYRP1基因的少量突變可導致人類眼皮膚白化病3型。Cirera等[25]發(fā)現(xiàn)TYRP1基因內(nèi)含子2中1個長插入片段與美洲水貂帕洛米諾毛色表型存在關(guān)聯(lián)。綜上，一般認為TYRP1基因是影響水貂毛色變淡的主效基因，下一步應加大水貂群體數(shù)量，進行該基因與水貂毛色相關(guān)變異位點的篩查工作，檢測到的變異位點可作為水貂毛色選育的遺傳標記位點，從而加速新毛色和新品種水貂的培育。

Agouti是真黑色素與褐黑色素合成的開關(guān)[26]。Agouti基因位點首次被發(fā)現(xiàn)是由于其對哺乳動物被毛色素類型和時間沉積的影響[27]，現(xiàn)在已經(jīng)在小鼠的Agouti基因位點發(fā)現(xiàn)了許多突變，其中一些影響皮毛顏色。宋興超等[28]發(fā)現(xiàn)Agouti基因內(nèi)含子2上的SNPs（g.1189CT）的CT基因型與吉林白水貂被毛表型顯著相關(guān)；在內(nèi)含子3中的1個SNPs（g.252CT）位點CT基因型與珍珠水貂的毛色具有相關(guān)性，同時發(fā)現(xiàn)5個SNPs和2個缺失突變位點在不同毛色水貂群體中分別處于緊密連鎖狀態(tài)且可能與水貂淺色被毛表型相關(guān)。因此，水貂Agouti基因g.1189CT和g.252CT這兩個變異位點可能是影響美洲水貂被毛顏色的分子遺傳標記位點，這為研究美洲水貂毛色的選育奠定了理論依據(jù)。

最新研究針對兩種群美國水貂進行了全基因組測序，發(fā)現(xiàn)MLPH基因和MITF基因與銀藍水貂和黑眼白水貂毛色表型相關(guān)[29]。MLPH編碼黑素親和素參與黑素體運輸?shù)腞ab蛋白并且能使黑素體結(jié)合的RAB27A基因和運動蛋白MYO5A相互作用，MLPH包含N-末端rab27結(jié)合域（RBD）、內(nèi)側(cè)肌O5A結(jié)合域（MBD）和C-末端肌動蛋白結(jié)合域（ABD），增強了MLPH與MYO5A12的相互作用且C端域能與微管相關(guān)蛋白EB1[29,30]相互作用。成熟黑素小體在細胞內(nèi)運行是以RAB27A-MLPH-MYO5A三重復合體的形式[29]。研究發(fā)現(xiàn)，銀藍色水貂MLPH基因的外顯子7缺失，導致發(fā)生移碼突變和308位氨基酸變?yōu)榻K止密碼子[29]，該突變使蛋白缺失C端肌動蛋白結(jié)合域和外顯子F結(jié)合域（EFBD），且兩者都是MYO5A結(jié)合域的組成部分。之前的研究表明，MBD的EFBD區(qū)域?qū)τ赗AB27A-MLPH-MYO5A三重復合體的形成是必需的，而MYO5A-MLPH的結(jié)合需要ABD區(qū)域[29]，因此MYO5A的功能缺失干擾了成熟黑素體向富含肌動蛋白的黑素細胞樹突尖端的運輸，導致毛色變淺。大量研究表明MLPH基因與銀藍色貂毛色具有相關(guān)性[29，30]，采用全基因組測序方法在MLPH基因剪接供體位點發(fā)現(xiàn)了一個可能導致功能喪失的單核苷酸變異GL896909.1:662639 G/A（MLPHC.901+1G＞a），該突變位點與銀藍水貂表型有關(guān)[29]。另外的研究也證實相同的結(jié)論，Cirera等[31]研究發(fā)現(xiàn)銀藍水貂MLPH蛋白的基因組序列中缺少內(nèi)含子7和部分內(nèi)含子8，在cDNA水平上缺少完整的外顯子8，導致其結(jié)合域非常短，造成MYO5A Va結(jié)合域的功能喪失。這一突變使黑素體在黑素細胞中分布減少，并最終導致淡銀藍色的被毛。此外，研究證實了之前關(guān)于水貂遺傳的信息，表明控制銀藍色的基因座存在不止一個等位基因[32]。進一步采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism,SSCP）技術(shù)對我國遼西地區(qū)標準色與深咖啡色水貂的MLPH基因外顯子進行遺傳多態(tài)性分析，但未檢測到變異位點，分析認為該基因在這兩種色型水貂個體間相對保守，也可能由于PCR-SSCP在方法上的局限，對于那些不影響單鏈構(gòu)象的SNPs，試驗過程中也可能被漏掉[33]。綜上，可以針對MLPH基因進行限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）、微衛(wèi)星、PCR-SSCP和單核苷酸多態(tài)位點（SNPs）等多種分子標記研究，從而找到影響水貂毛色的關(guān)鍵性突變，為培育出彩色水貂提供重要依據(jù)。

MITF基因的黑素細胞-特異功能異構(gòu)體MITF-M能影響神經(jīng)嵴源性黑素細胞的發(fā)育，使毛皮顏色發(fā)生白化，研究發(fā)現(xiàn)MITF的基因座與黑眼白水貂的表型具有相關(guān)性[32]。早期的研究并沒有在黑眼白水貂的MITF基因中篩查到變異位點，但最新研究發(fā)現(xiàn)MITF基因GL896899.1:18635719G/A位點的變異與黑眼白水貂被毛表型相關(guān)[29]。

2 分子育種技術(shù)在水貂針絨毛性狀相關(guān)基因中的應用

毛絨品質(zhì)是毛的顏色和純度、毛的結(jié)構(gòu)和長度以及毛的密度等的綜合性狀，水貂的毛絨品質(zhì)由被毛密度、針毛和絨毛長度、絨毛細度及針絨毛長度比等因素決定。被毛密度是影響毛皮品質(zhì)的重要因素，被毛稀疏會讓毛皮看起來雜亂、無光澤[34]。為了得到較好針絨毛長度的水貂后代，我們應選育絨毛豐厚、長度較長的水貂親代，在冬毛期注重水貂的飼料營養(yǎng)配比[35]。針絨毛長度比應適當才可以保證毛皮的外觀和質(zhì)量。Cadieu等[36]研究發(fā)現(xiàn)，影響水貂毛長度、粗度和卷曲毛發(fā)變異的主效基因非常少。Thirstrup等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在9個常染色體上發(fā)現(xiàn)QTL對水貂毛長度和毛密度均有影響。已有研究表明，犬的短毛比長毛占優(yōu)勢，而長毛性狀是由FGF5（fibroblast growth factor 5）基因突變引起的[38]。研究FGF5基因的BAC文庫發(fā)現(xiàn)1個微衛(wèi)星標記（RAN110），其與被毛長度性狀無顯著相關(guān)性。在水貂的11號染色體上，在RAN110標記附近發(fā)現(xiàn)了1個與被毛長度性狀相關(guān)的QTL[39]。

成纖維細胞生長因子5（FGF5）是纖維母細胞生長因子家族的一員，目前的研究認為FGF5主要通過影響周期性活動，控制毛囊從興盛期向休眠期轉(zhuǎn)換，最后影響了被毛的長度[40]。Jin等[41]使用RNA-seq測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)通過促進FGF5基因的表達來調(diào)控絨山羊毛發(fā)的生長發(fā)育。梁東[42]針對FGF5基因在不同品種水貂體組織中的表達量進行差異分析，發(fā)現(xiàn)FGF5基因mRNA在美國短毛黑色水貂中表達量要高于金州黑色標準水貂，并且金州黑色標準水貂較美國短毛黑水貂針毛長差異極顯著（P＜0.01）。筆者得出FGF5基因的表達量與水貂針毛長相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在犬的第13號染色體上有1個RSPO2（R-spondin2）基因，該基因可影響毛的細度，RSPO2基因位于水貂4號染色體上并檢測到一個可能影響水貂毛細度的數(shù)量性狀基因座[39]。下一步研究應運用PCR-RFLP分子育種技術(shù)篩查水貂FGF5基因和RSPO2基因與毛長、毛細度性狀相關(guān)的突變位點，上述突變位點可作為水貂毛長性狀選育的分子遺傳標記，進一步加速水貂的育種工作。

3 小結(jié)與展望

毛絨品質(zhì)是毛皮動物的重要生產(chǎn)性狀和主要育種目標，也是一種可利用的遺傳標記，在確定雜交組合、品種純度和親緣關(guān)系等方面均有一定的用途。另外，水貂皮的絢麗多彩和經(jīng)濟價值也存在直接的關(guān)系，可以根據(jù)人們的需要及毛皮市場行情，利用分子標記輔助選擇技術(shù)加快彩貂新品種的培育，毛皮動物養(yǎng)殖的經(jīng)濟價值也必將得到進一步提高。

分子標記輔助育種是篩選與育種目標性狀緊密連鎖的分子標記，是目前應用最廣泛的分子育種方法。傳統(tǒng)育種是在表型上進行選擇而不關(guān)注基因型的改變，而分子標記輔助選擇育種則注重基因型的改變。傳統(tǒng)選育過程中由于表型較好，但基因型不穩(wěn)定的現(xiàn)象出現(xiàn)，導致后代發(fā)生性狀分離，難以培育優(yōu)良的品系。然而分子輔助選擇育種能夠突破這一限制，可快速穩(wěn)定地獲得優(yōu)良品系[43]。分子標記雖然為水貂育種開辟了一扇大門，但能否在育種實踐中發(fā)揮應有的作用，還需要注意以下4個方面：是否能找到與目的基因性狀緊密連鎖的分子標記；是否能繪制遺傳標記多態(tài)性豐富的遺傳圖譜；能否實現(xiàn)自動化分析分子標記，簡化試驗，大大降低成本；是否能改進預測育種值的方法。當前，分子育種技術(shù)在水貂育種中取得了一定的成果，已經(jīng)篩查到大量的變異位點與水貂經(jīng)濟性狀相關(guān)，這些位點可作為分子標記；利用微衛(wèi)星標記、RAMP、PFLP和MAS技術(shù)進行水貂遺傳多樣性的研究，為繪制遺傳標記多態(tài)性豐富的遺傳圖譜提供理論數(shù)據(jù)；成功通過BLUP數(shù)字模型方法進行水貂育種值預測，為下一步育種奠定理論基礎。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標記將在水貂育種中占有重要地位。