羅友梅 陳瑞雅 李小勇 張銳杰 李思思 李銳新 賀新生

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

食用菌生產(chǎn)者、研究者普遍使用各種生物顯微鏡對食用菌菌絲體、霉菌、細菌等培養(yǎng)物進行觀察，傳統(tǒng)的方法都需要用載玻片制片觀察，無法原位直接觀察試管、培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)物，包括：培養(yǎng)物在培養(yǎng)基中的自然生長狀態(tài)，如基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、菌絲的自然分枝角度、分生孢子分枝的形態(tài)、分生孢子的著生狀態(tài)、氣生菌絲老化情況、菌絲的鎖狀聯(lián)合、菌核、厚垣孢子等；培養(yǎng)物中的雜菌，如細菌、霉菌黏菌等的污染狀態(tài)。而使用帶攝像頭的生物攝影顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，可以直接獲得圖像，便于學術(shù)交流和現(xiàn)場教學、網(wǎng)絡直播交流，但其價格昂貴，使用成本高。

隨著智能手機的攝像功能的日益完善，有研究者嘗試直接用手機鏡頭直接對著顯微鏡的目鏡進行拍攝[1,2]，也有報道運用手機和三腳組合成拍照裝備在顯微鏡下觀察水霧動態(tài)視頻的方法[3]。已有手機與生物顯微鏡連接裝置的實用新型專利，如黃馨穎等[4]申請的一種顯微鏡用手機定位拍攝輔助裝置。該裝置結(jié)構(gòu)由目鏡固定架和顯微鏡鏡頭構(gòu)成，其顯微鏡目鏡用固定架鎖緊調(diào)平后使用，解決了顯微鏡拍攝設備造價高、定位不準確、易抖動的問題。陳曉曦[5]發(fā)明一種智能手機與顯微鏡頭的可拆式連接座，連接座包括與智能手機背面緊貼的貼合板，以及從貼合板兩端延伸而出并包覆智能手機兩側(cè)邊緣的一對夾合板，兩夾合板分別設置有用于彈性夾緊智能手機正面的彈性卡指。沈明學[6]發(fā)明一種顯微鏡用手機鏡頭連接器，包括很多個調(diào)節(jié)座。鄧超[7]提到制作支架用來固定手機，可以觀察多臺顯微鏡下的標本圖像，提高觀察效率，方便師生交流。

本文結(jié)合多年的實踐經(jīng)驗，介紹一種用便攜式支架固定手機，直接在顯微鏡目鏡上照相，原位觀察試管或培養(yǎng)皿中的食用菌菌絲及霉菌、細菌等的操作方法。

1 器 材

智能手機1 臺，手機支架1 個，普通生物顯微鏡1 臺，物鏡放大倍數(shù)2×、4×、10×、20×、40×、100×。試管斜面培養(yǎng)物，培養(yǎng)皿培養(yǎng)物。

2 操作方法

2.1 試管及培養(yǎng)皿的放置

如圖1所示，將已培養(yǎng)好的食用菌試管放置在顯微鏡的載物臺上，試管斜面垂直于載物臺，斜面邊緣與物鏡鏡頭中央對齊，觀察培養(yǎng)基邊緣的氣生菌絲；斜面培養(yǎng)基背面朝上，可以觀察培養(yǎng)基內(nèi)的菌絲。用4×、10×的物鏡直接原位觀察菌絲形態(tài)。在不影響觀察的前提下，可用其他物體將試管固定。

圖1 試管斜面培養(yǎng)物的放置

如圖2所示，培養(yǎng)皿背面朝上，放在載物臺上，用4×、10×的物鏡可以觀察培養(yǎng)基內(nèi)的菌絲體；將培養(yǎng)皿打開，放在載物臺上，用4×、10×、20×、40×、100×的物鏡可以觀察菌絲和細菌的形態(tài)。

圖2 培養(yǎng)皿的放置

2.2 構(gòu)建智能手機和便攜式支架的組合體

把手機固定在支架的卡槽上，有利于在后續(xù)的操作中對設備進行微調(diào)，同時防止因手的抖動造成手機聚焦困難。首先將支架放于水平桌面上，將智能手機安裝固定于支架上的裝載手機位置，使兩者形成一個組合體。調(diào)節(jié)手機后置攝像頭與水平面的角度，盡量達到兩者平行。

2.3 顯微鏡的調(diào)節(jié)

首先調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換器，將物鏡轉(zhuǎn)換成4×物鏡。然后進行對焦，人眼通過目鏡觀察載物臺上的培養(yǎng)物，用右手順時針、逆時針來回轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，直到視野中出現(xiàn)清晰的圖像，對焦完成。對好焦后即可再次轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，調(diào)至10×物鏡，此時不再轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，而是通過調(diào)節(jié)細準焦螺旋來對焦（方法同粗準的調(diào)節(jié)一致），從而將物體放大。若調(diào)節(jié)細準無果，可輕微來回轉(zhuǎn)動粗準來對其進行對焦。之后用相同的步驟將物鏡依次換至40×、100×，以進一步原位觀察菌絲的形態(tài)。由于隨著放大倍數(shù)的增大，視野中的光線會變暗，可通過適當調(diào)大光圈、調(diào)整燈源亮度和聚光器位置等方法加以解決。通過對粗調(diào)旋鈕、細調(diào)旋鈕及光圈、聚光器等的調(diào)整，便可在目鏡內(nèi)看見清晰的菌絲圖像。

2.4 組合體與顯微鏡結(jié)合

將組合體移至顯微鏡的正前方，調(diào)節(jié)手機支架的高度，使手機的高度高出顯微鏡的目鏡1～2 cm即可。打開手機的照相功能。開始調(diào)節(jié)手機攝像頭與水平面的角度使手機攝像頭與目鏡平行，同時調(diào)節(jié)手機攝像頭與目鏡兩者連線的距離，使手機的屏幕中可以看到一個完整且大致清晰的圖像，并盡量調(diào)整到可以看見完整圖形的最大值（大致為4 cm）。

2.5 手機對焦以及拍攝

雙手緊貼手機支架的底部，可將其在水平面內(nèi)前后左右移動，直到手機內(nèi)可以大致看見菌絲體的形態(tài)。在確定好組合體和顯微鏡的距離，以及目鏡和攝像頭的距離后，輕點手機屏幕對其對焦，在可以清晰地看見菌絲體結(jié)構(gòu)后，開始照相。也可在調(diào)節(jié)好后，再微調(diào)細準焦螺旋，使手機內(nèi)的圖像更為清晰。

2.6 單根菌絲生長動態(tài)的拍攝

先把培養(yǎng)皿打開，將培養(yǎng)物放在載物臺上，調(diào)節(jié)顯微鏡粗、細調(diào)節(jié)旋鈕，選擇菌落邊緣的單根菌絲放在視野的最邊緣，用透明膠帶固定培養(yǎng)皿在載物臺上的位置。將手機和支架組合體放在目鏡上方合適的位置進行拍照。針對不同生長速度的物種，每間隔1 小時或數(shù)小時定時拍照。最后把采集到的圖片用動畫軟件編輯為連續(xù)的視頻。

2.7 菌絲中原生質(zhì)流動的拍攝

把培養(yǎng)皿打開，將培養(yǎng)物直接放在載物臺上。用40×或100×物鏡觀察，選擇單根菌絲進行觀察，如菌絲直徑在5～20 μm 的羊肚菌、雙孢蘑菇、毛霉、根霉等的菌絲，可以用手機拍視頻，觀察菌絲中原生質(zhì)的流動方向和流動速度。

3 實 例

用上述方法觀察拍攝到的各種食用菌菌絲及霉菌、細菌實例見圖3～5。

圖3 在10×物鏡下原位觀察到的毛霉菌絲和被細菌污染的羊肚菌菌絲

圖4 在100×物鏡下原位觀察到的羊肚菌菌絲與桿狀細菌

圖5 在100×物鏡下原位觀察到的羊肚菌菌絲

4 注意事項

由于目前大部分智能手機的后置攝像頭有2～3 個或以上，在拍照之前應進行初試，找出成像最清楚的那一個再進入后續(xù)操作。手機的后置攝像頭應與目鏡靠近但不完全與其接觸，要保持一定距離。在點擊手機屏幕以及拍照時應輕點，否則可能會導致支架劇烈晃動而難以聚焦，也可以選擇質(zhì)量大的金屬支架予以避免。

原位觀察試管中的菌絲，最好用一個重物放在載物臺外側(cè)，擋住試管，以免試管滾落摔破。最好使用15×150（mm）規(guī)格的試管，其放在十字推進器上可以左右移動，便于用4×、10×物鏡直接觀察。使用18×180（mm）試管，放在十字推進器上無法聚焦，而直接放在載物臺上觀察，又不便于固定和移動，觀察較困難；使用20×200（mm）的試管也很難直接觀察。使用玻璃、聚丙烯材質(zhì)的培養(yǎng)皿直接觀察，效果都很好。

在目鏡中放入目鏡測微尺，對培養(yǎng)皿中的單根菌絲進行定位、定時測量，可以測定菌絲的生長速度。

試管、培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基應使用透明度高的培養(yǎng)基配方，最好使用質(zhì)量較好的瓊脂粉。培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基厚度一般不要超過2 mm。