侯淑潔 張 勉 王賀林

血管鈣化在糖尿病、慢性腎臟疾病和動脈粥樣硬化等疾病中常見[1]。研究表明，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)來源的外泌體在血管鈣化的過程中發(fā)揮了重要作用，研究外泌體在血管鈣化中的作用機制對于心血管疾病的防治有重要意義。

一、外泌體

外泌體首次由Johnsone在體外培養(yǎng)網織紅細胞時發(fā)現(xiàn)，與網織紅細胞成熟為紅細胞的過程相關。外泌體在核內體網絡中形成，部分晚期核內體靶向與質膜融合后將包含的30～100nm囊泡至細胞外腔，成為外泌體。外泌體是細胞外的生物信息載體之一，可以向靶細胞轉運多種類型的功能性轉錄，進而引起受體細胞表型改變[2]。不同類型的細胞通過旁分泌等方式將外泌體分泌到體液或各種微環(huán)境中，并在鄰近區(qū)域或遠處細胞中發(fā)揮作用[3]。外泌體在臨床中的應用價值很大，研究表明，循環(huán)系統(tǒng)中外泌體內長鏈非編碼RNA可以作為早期檢測和監(jiān)測胃癌進展的生物學標志物[4]。可根據(jù)外泌體中蛋白表達的差異篩選潛在的藥物靶標蛋白[5]。起源于血管內皮細胞的病理性外泌體、基質細胞和巨噬細胞在血管鈣化中發(fā)揮重要作用。因此外泌體不僅參與炎癥、增生、血栓形成、血管活性反應等生理病理過程，還能促進血管鈣化。

二、血管鈣化

血管鈣化是礦物質在血管系統(tǒng)中的病理沉積，導致血管壁彈性降低和血管結構完整性受損。血管鈣化影響廣泛，它不僅是正常衰老的一部分，也與動脈粥樣硬化、糖尿病、某些遺傳疾病和腎臟疾病有關，目前臨床上仍無有效的血管鈣化治療方法[6]。通常根據(jù)鈣化物在血管中沉積部位不同將其分為內膜鈣化和中膜鈣化(也稱monckeberg內側鈣化)。內膜鈣化與脂質沉積和炎性細胞浸潤密切相關，在粥樣硬化病變中常見。而內側鈣化顯著表現(xiàn)為VSMCs轉化為成骨樣細胞。內側鈣化是一個主動的生物調節(jié)過程，類似于骨形成，可導致血管硬度增加和血管順應性降低。血管鈣化原因復雜，包括VSMCs的不穩(wěn)定性增加、鈣/磷酸鹽調控失常、彈性蛋白的降解、破骨細胞的分化和凋亡等[7]。來自VSMCs、基質細胞和巨噬細胞的外泌體是心臟瓣膜和動脈粥樣硬化斑塊鈣化的重要介質。

三、血管平滑肌細胞及其外泌體可參與血管鈣化

1.血管平滑肌與鈣化：VSMCs為血管提供結構支持并使其具有收縮功能，在健康成人血管中，它們以極低的速率增殖，并表達獨特的收縮蛋白。在血管損傷的修復、應答血流動力學改變時的血管重塑，或在各種疾病狀態(tài)時，它們會去分化為一種合成表型，從而分泌外泌體、增殖、并遷移到損傷處進行修復。這個過程被稱為表型轉換，通常為血管病變的第一步。血管系統(tǒng)的一些病變與VSMCs的表型轉化有關，如動脈粥樣硬化、再狹窄和鈣化等[8]。

VSMCs是血管鈣化的關鍵因素。收縮型VSMCs向骨/軟骨形成型VSMCs的表型轉換過程伴隨著調節(jié)細胞外基質礦化的骨特異性蛋白的表達。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是成骨的主要調節(jié)因子，結合BMP受體并激活SMAD信號，從而導致骨/軟骨生成轉錄因子如RUNX2、Osterix的表達和活性增加，這些轉錄因子控制礦化調節(jié)因子的表達，如組織非特異性堿性磷酸酶(tissue non-specific alkaline phosphatase，TNAP)、骨鈣素、骨橋蛋白、骨保護素和骨涎蛋白[9]。應激信號可以通過多種機制誘發(fā)VSMCs凋亡增加和外泌體釋放，進而促進鈣化，此時外泌體內成分改變，基質γ-羧基谷氨酸蛋白(matrix gla protein，MGP)等天然鈣化抑制劑明顯減少[10]。

2.血管平滑肌來源的外泌體與鈣化：Tanimura在1983年的研究表明，基質小泡(matrix vesicles，MVs)樣結構參與動脈粥樣硬化病變的鈣化以及動脈內側鈣化。在解剖患有動脈粥樣硬化的人、兔、雞的主動脈中，發(fā)現(xiàn)MVs源自內膜中的細胞成分，主要源自VSMCs。Kapustin等[11]利用alexa488標記的胎球蛋白A研究了MVs的生物發(fā)生在VSMCs鈣化中的調控和作用，并將MVs明確識別為外泌體。在長期的應激和礦物質失衡狀態(tài)下，VSMCs可以轉化為合成表型，而外泌體的分泌是合成表型VSMCs的一個重要特征，而后將其轉化為鈣化狀態(tài)。該過程最可能的途徑是激活鞘磷脂磷酸二酯酶3(sphingomyelin phosphodiesterase 3，SMPD3)和細胞骨架重構。細胞外鈣水平升高引起VSMCs外泌體組成和磷脂酰絲氨酸、膜聯(lián)蛋白A6(annexin a6，AnxA6)和基質金屬蛋白酶-2的積累發(fā)生顯著變化，從而使外泌體變成一個鈣化的病灶。VSMCs釋放的鈣化外泌體是形成微鈣化的最小分子。材料成像技術顯示，VSMCs衍生的鈣化外泌體在向細胞外基質釋放時，容易在膠原稀疏的區(qū)域聚集形成微鈣化，大的鈣化則是由微鈣化累積而成，并逐漸形成成熟的礦物質。膠原蛋白作為支架來引導生長過程中鈣化的形狀和大小[12]。

四、血管平滑肌細胞來源外泌體的影響因素

1.鈣與磷酸鹽的影響：為了應答礦物質代謝失調，血管平滑肌會發(fā)生適應性改變，包括外泌體的釋放。電子顯微鏡觀察在血管細胞外基質中，不斷沉積的類似外泌體結構的小囊泡內含有鈣磷的結晶。這些適應性改變最終造成了VSMCs的凋亡和異常鈣化。細胞外鈣水平升高可誘導VSMCs衍生的外泌體礦化。蛋白質組學顯示，VSMCs來源的外泌體與軟骨細胞來源的MVs有相似之處，包括豐富的鈣結合蛋白，即膜聯(lián)蛋白A2、AnxA5和AnxA6，AnxA6在外泌體膜上的定位不同，其功能也有所差異[13]。帶有AnxA5和TNAP的外泌體與礦化血管平滑肌細胞產生的天然膠原蛋白基質結合AnxA6可穿過質膜，在體內的血管鈣化部位也很豐富，而針對AnxA6的小干擾RNA則可以降低VSMCs礦化[14]。除了AnxA6之外，鈣誘導的磷脂酰絲氨酸暴露于外泌體表面，從而提供了羥氧化鉀磷灰石的成核位點。與在軟骨細胞基質囊泡中觀察到的協(xié)調信號轉導反應相反，VSMCs外泌體的礦化是細胞內鈣穩(wěn)態(tài)紊亂的病理反應，導致抑制劑消耗和AnxA6-磷脂酰絲氨酸成核復合物的形成。該研究表明維持正常血鈣水平、減少短暫性高鈣血癥的發(fā)作對心血管疾病患者，尤其是慢性腎病患者，具有很重要預防血管鈣化的意義。

VSMCs和成骨細胞具有相似的間充質來源，在病理壓力下，VSMCs可以表現(xiàn)出成骨樣表型。在高磷酸鹽血液環(huán)境(如慢性腎臟疾病)或炎癥驅動的動脈粥樣硬化中，VSMCs上調成骨分化基因的表達，并釋放富含促鈣化生物學標志物的外泌體[15]。高磷酸鹽血癥能夠降低循環(huán)系統(tǒng)中細胞外礦化抑制分子胎球蛋白-A和MGP蛋白的水平，但VSMCs外泌體中促進細胞外礦化的TNAP和AnxA2、AnxA6的含量則升高，活性TNAP可導致磷酸增加，并減少焦磷酸等礦化抑制劑的含量。鈣化性外泌體的形成始于細胞內一系列的轉運過程，分揀蛋白(sortilin)作為一種特殊的轉運蛋白，在VSMCs分泌的鈣化性外泌體形成中起關鍵作用。

sortilin將TNAP轉運到VSMCs衍生的外泌體中，從而增加外泌體的鈣化潛能。研究表明鈣化外泌體的形成過程中，sortilin 通過反式高爾基體(trans-golgi network，TGN)來運輸，經過磷酸化，結合TNAP形成胞內體，經過了核內的Rab11途徑到達細胞膜表面特定的小凹蛋白1。在此過程中，sortilin/TNAP復合物就會進入外泌體，從而增強外泌體的促鈣化的作用。Nε-羧甲基賴氨不僅影響從VSMCs釋放外泌體，而且還影響sortilin進入外泌體，從而促進糖尿病性動脈粥樣硬化[16]。這一發(fā)現(xiàn)可能為針對性預防糖尿病血管鈣化提供新的策略。此外，正常血管在對照和高P培養(yǎng)基中均未見囊泡標志物AnxA6陽性，但在高Ca + P培養(yǎng)基中培養(yǎng)后在中膜中可見少量點狀陽性區(qū)域。而透析血管在對照中呈斑片狀彌散染色，在高P的培養(yǎng)基中陽性區(qū)域增加，在高Ca + P的培養(yǎng)基中陽性區(qū)域最大，這表明病變血管在高鈣高磷同時存在的條件下誘導沉積的外泌體最多，最易發(fā)生鈣化[17]。

此外，有研究還證實血管的鈣化擴張是從鈣化的VSMCs延伸到鄰近的正常細胞，該過程通過外泌體誘導的細胞信號改變而實現(xiàn)。利用慢性腎臟病大鼠VSMCs中分離出的外泌體，與正常仔鼠的VSMCs共同培養(yǎng)，可見正常小鼠的VSMCs作為受體細胞對小泡的內吞作用。外泌體還可通過誘導受體VSMCs的細胞信號改變和受體細胞的表型改變來加速受體VSMCs的鈣化。此外，只有VSMCs來源的外泌體可以誘導受體正常的VSMCs內鈣離子濃度、NADPH氧化酶-1(nadph oxidase 1，NOX1)和抗氧化超氧化物歧化酶-2的含量升高。細胞內鈣離子濃度的增加一方面是由于內質網的釋放，另一方面是部分歸因于NOX1和絲裂原激活蛋白激酶類(MEK1和Erk1/2)信號的激活，因為抑制這兩種途徑都會阻止受體VSMCs細胞內鈣離子的增加。相反，從培養(yǎng)基中分離的外泌體對細胞內鈣離子濃度或MEK1信號沒有影響，也沒有誘導鈣化。但這些外泌體確實增加了Erk1/2和NOX1的表達，阻斷NOX活性進一步抑制了外泌體誘導的受體VSMCs鈣化加速，表明這種抑制具有潛在的治療作用[18]。

2.膠原纖維對外泌體釋放的調節(jié)作用：膠原纖維能夠結合和引導外泌體鈣化。VSMCs衍生的鈣化外泌體一旦釋放到細胞外基質中，傾向于聚集在膠原稀疏的區(qū)域形成微鈣化，而大鈣化由微鈣化堆積而成，逐漸形成成熟礦物。將VSMCs在促鈣化條件下的膠原蛋白水凝膠體系內進行培養(yǎng)，模擬動脈粥樣硬化病變的各個時期，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白作為支架可以引導生長過程中產生的鈣化點的形狀和大小。動脈中的I型和Ⅲ型膠原纖維，則能與外泌體膜結合并介導其在細胞外基質中的鈣化傳播。膠原纖維也可能在VSMCs內的表型改變和外泌體形成中發(fā)揮作用。盤狀結構域受體-1(discoidin domain receptor，DDR-1)是一種膠原受體，它通過感受細胞外膠原成分變化調節(jié)VSMCs表型，缺乏DDR-1的VSMCs會增加膠原生成、外泌體釋放和礦物質沉積[19]。研究證實，DDR-1通過轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)途徑調節(jié)VSMCs的膠原沉積和鈣化外泌體的釋放，而在動脈粥樣硬化中，膠原積累和鈣化是動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的主要決定因素[20]。因此，DDR-1與TGF-β通路相互作用對動脈粥樣硬化斑塊形成及其細胞外基質穩(wěn)態(tài)機制具有重要意義[21]。Ⅰ型膠原蛋白序列中特定的六氨基酸重復序列(six-amino-acid repeat，GFOGER)參與了Ⅰ型膠原纖維與外泌體上表達的整合素的相互作用，可以降低VSMCs來源的外泌體中與鈣化有關蛋白的含量，從而抑制鈣化[22]。

3.其他影響因素：動脈中層鈣化是由VSMCs異常釋放的外泌體介導，而細胞分泌的外泌體與溶酶體活性有關。黏質蛋白1(mucolipin 1，Mcoln1)基因缺失的小鼠VSMCs內溶酶體定位異常，外泌體分泌增多，這可能是導致動脈內側鈣化的原因之一[23]。此外，動脈內側鈣化還與細胞外基質、動脈VSMCs中羥基鎂的結晶有關，從而導致動脈順應性降低。在溶酶氨基酸鞘磷脂酶(小鼠基因編碼:SMPD1)衍生的神經酰胺是否促進VSMCs分泌外泌體導致動脈中層鈣化的研究中，發(fā)現(xiàn)SMPD1轉基因小鼠的溶酶體酸鞘磷脂酶(小鼠基因編碼：SMPD1)衍生的神經酰胺在VSMCs的表型變化和外泌體的釋放中起著關鍵的作用，可能導致內側鈣化的發(fā)展[24]。VSMCs中Asah1基因缺失也會導致動脈中層鈣化[25]。在對外泌體釋放的調控途徑研究中發(fā)現(xiàn)，SMPD3在VSMCs分泌外泌體中起到重要作用，外泌體的分泌是對SMPD3的上調做出反應，其釋放受到成骨刺激、細胞因子和生長因子的動態(tài)調節(jié)。

細胞應激對外泌體的釋放有影響，有研究表明細胞自噬與外泌體的釋放有關，對細胞自噬進行調節(jié)會影響外泌體的釋放，CD137-CD137配體信號通路可以通過Rab7分子調控VSMCs自噬從而影響外泌體的分泌[26]。激活VSMCs中CD137信號通路可以上調T細胞核因子C1在外泌體中的表達從而介導VSMCs鈣化[27]。體外高鈣環(huán)境可誘導SMPD3的表達促進VSMCs分泌鈣化外泌體，該類外泌體具有MGP含量低、羥基磷灰石含量高的特點，從而將礦物沉積初始化為微鈣化。外泌體中的miR-204/miR-211介導了VSMC外泌體的旁分泌作用，經褪黑素處理的VSMCs外泌體可以通過miR-204/miR-211以旁分泌、褪黑素-褪黑素膜受體依賴性作用方式減弱VSMCs的成骨分化和衰老[28]。在高血糖刺激下，血管內皮細胞分泌的外泌體中含有蛋白聚糖和Notch3，調節(jié)血管平滑肌細胞的鈣化/衰老[29]。其中Notch3在人臍靜脈內皮細胞中通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路調節(jié)VSMCs的鈣化[30]。

五、展 望

血管鈣化與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關，而VSMCs是參與血管鈣化的主要細胞，近年來對VSMCs外泌體的研究有利于進一步揭示其參與調節(jié)鈣化的機制。在血流動力學發(fā)生改變或各種疾病狀態(tài)時，VSMCs產生應激，多種信號通路激活引起外泌體分泌以及外泌體成分含量的變化，進而促進血管鈣化。VSMCs基因表達的改變以及鈣磷濃度等均會對外泌體參與鈣化產生影響。但VSMCs外泌體參與鈣化的具體機制和影響因子較為復雜，目前尚未完全明確，有待進一步的研究完善。目前對外泌體參與血管鈣化的研究可以為臨床上如高血壓、動脈粥樣硬化、動脈瘤形成、慢性腎臟疾病等疾病的預防和治療提供更好的靶點和新的治療策略。