李佳園，徐 文，萬國慧，魏曉嘉，楊 雪，劉金鳳，于佳禾，金重先，呂 研，王雨青，石晉麗

? 藥理與臨床 ?

基于網絡藥理學及實驗驗證探究甘松治療帕金森病伴發(fā)焦慮的作用機制

李佳園，徐 文，萬國慧，魏曉嘉，楊 雪，劉金鳳，于佳禾，金重先，呂 研，王雨青，石晉麗*

北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488

基于網絡藥理學方法預測甘松治療帕金森病伴發(fā)焦慮（Parkinson’s disease with anxiety，PDA）的作用靶點和信號通路，并通過PDA模型大鼠進行藥效學和關鍵靶點的驗證。通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫分析平臺（TCMSP）和文獻挖掘獲得甘松主要化學成分，利用SwissTargetPrediction、GeneCards數(shù)據庫獲得甘松化學成分治療PDA的潛在靶點，對其進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，利用Cytoscape 3.7.2構建“成分-靶點-通路”網絡。大鼠采用頸背部sc魚藤酮制備PD模型，并通過曠場實驗篩選出PDA模型大鼠；設置對照組、模型組、甘松（620 mg/kg）組、左旋多巴（49 mg/kg）組，利用轉棒實驗、曠場實驗和免疫組化法對甘松治療PDA的藥效學進行評價；并對關鍵蛋白和大鼠腦內神經遞質含量進行測定?！俺煞?靶點-通路”網絡中包含甘松抗PDA的12個有效成分如甘松新酮、諾卡酮、金合歡素、β-谷甾醇等，絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinases 3，MAPK3）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和信號傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等99個靶點，主要涉及神經活性配體-受體相互作用、雌激素、FoxO、TNF等信號通路。實驗結果顯示，甘松延長了PDA大鼠在轉棒上的停留時間，增加了其在曠場的總活動距離及在中央區(qū)的活動時間和距離，提高了黑質區(qū)酪氨酸羥化酶陽性表達（＜0.05）；甘松顯著降低大鼠紋狀體MAPK3、TNF-α含量以及STAT3蛋白表達水平（＜0.05、0.01），提高了多巴胺、3,4-二羥基苯乙酸、高香草酸、5-羥色胺和5-羥吲哚乙酸水平（＜0.01、0.001）。甘松中的有效成分可能是通過MAPK3、TNF-α、STAT3等靶點調控多條信號通路來抑制神經炎癥反應，提高神經遞質水平以治療PDA疾病。

甘松；網絡藥理學；帕金森病伴發(fā)焦慮；炎癥因子；神經遞質；絲裂原活化蛋白激酶3；腫瘤壞死因子-α；信號傳導與轉錄激活因子3；甘松新酮；諾卡酮；金合歡素

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是我國第2大類神經退行性疾病[1]，主要臨床表現(xiàn)為進行性運動遲緩、肌肉僵直、靜止性震顫等運動障礙[2]。此外，一些非運動癥狀如焦慮、失眠、抑郁等也經常伴隨PD發(fā)生，近期有學者研究發(fā)現(xiàn)，這些非運動癥狀大多出現(xiàn)在整個病程中，有些甚至出現(xiàn)在運動癥狀發(fā)病之前[3]。其中，焦慮被認為是PD最常見且損傷性較大的非運動癥狀之一[4]，PD伴發(fā)焦慮（Parkinson’s disease with anxiety，PDA）的患者在PD患者中占40%～50%[5]，焦慮不僅降低了PD患者的生活質量，還會加重PD患者的運動障礙和認知表現(xiàn)[6]，嚴重阻礙PD患者身體健康的恢復。目前PDA的發(fā)病機制尚未闡明，但隨著研究的不斷深入，認為PDA的發(fā)病機制涉及炎性細胞因子的異常表達[7]，下丘腦、黑質、紋狀體的神經元功能退化及所含的多巴胺（dopamine，DA）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）等神經遞質的含量下降等方面[8]。臨床上常用的一些藥物如左旋多巴、美多芭、勞拉西泮和丁螺環(huán)酮等對PDA患者具有一定的緩解作用，但長時間服用會引發(fā)異動癥、睡眠障礙等不良反應，無法真正治療該疾病[9]。因此未來的研究應進一步明確PDA的發(fā)病機制，找尋治療PDA的有效靶點，提高藥物的臨床有效性和安全性。

甘松為敗醬科植物甘松DC.的干燥根及根莖，在藏藥中又被稱為邦貝，具有理氣止痛、開郁醒脾的功效[10-11]。李時珍在《本草綱目》中提出，甘松之甘源于“其味甘”，有補、和、緩之效，能理元氣、去氣郁、健脾胃[12]；在藏藥中，甘松之松源于藏語bsung，意為“氣味芳香”，有清熱、解毒、消炎之效[13]。《中國藥典》2020年版規(guī)定，甘松用量為3～6 g，且本品含甘松新酮（C15H22O3）不得少于0.10%。根據成人最高用量換算，得到大鼠口服劑量為620 mg/kg。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘松80%乙醇的提取物（620 mg/kg，以生藥量計）及甘松新酮均有良好的抗PD效果，其中甘松新酮治療PD的機制可能與抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JNK）信號通路的激活，抑制線粒體凋亡途徑，減少細胞的損傷有關[14]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，甘松提取物具有潛在的抗焦慮活性并具有劑量相關性[15]；甘松提取物能夠抑制脂多糖誘導的巨噬細胞凋亡，抑制炎性細胞因子，從而發(fā)揮抗炎作用[16]；此外，甘松還具有抗癲癇[17]、抗抑郁[18]等作用。綜合甘松的傳統(tǒng)功效和現(xiàn)代藥理研究結果，推測甘松具有治療PDA的潛力，但目前尚未有學者對甘松治療PDA的藥效和作用機制展開深入研究。因此本研究基于網絡藥理學方法，對甘松治療PDA的關鍵靶點和信號通路進行預測，并利用PDA模型大鼠對其藥效學和關鍵靶點進行驗證，以期為甘松治療PDA的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學預測甘松治療PDA的作用機制

1.1.1 甘松化學成分的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/ tcmspsearch.php），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、化合物類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件，對甘松的化學成分進行篩選；同時采用文獻挖掘的方式收集甘松中的化學成分；將檢索到的化學成分進行整合并去重，得到最終化學成分。

1.1.2 化學成分和PDA的相關靶點收集 利用PubChem數(shù)據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得上述化合物的SMILES號，通過SwissTarget Prediction網站（http://www.swisstargetprediction. ch/）預測甘松化學成分的潛在靶點。利用GeneCards數(shù)據庫（https://www.genecards.org/），以“Parkinson’s disease with anxiety”為檢索詞獲取相關性得分≥10的PDA靶點。應用R語言軟件對甘松化學成分和PDA的相關靶點取交集，得到兩者的共同靶點，即甘松治療PDA的潛在作用靶點。

1.1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建與分析 在STRING平臺（https://STRING-db.org/）輸入潛在作用靶點，獲得PPI網絡。利用Cytoscape 3.7.2軟件，對PPI網絡進行可視化操作，根據Network Analyzer插件中的度值和介數(shù)評估每個靶點的重要性，得到關鍵靶點。

1.1.4 靶點功能富集分析與網絡構建 通過DAVID數(shù)據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對甘松治療PDA的潛在靶點進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，利用SangerBox平臺（http://sangerbox.com/）的高級氣泡圖對排名前20的通路進行可視化分析。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“成分-靶點-通路”網絡，根據Network Analyzer插件對該網絡進行拓撲學分析，確定關鍵化學成分。

1.2 實驗驗證

1.2.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體質量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心，環(huán)境溫度（20～22）℃，濕度（40～60）%，12 h光暗周期，自由進食飲水。動物實驗方案符合國家實驗動物福利倫理的相關要求，并獲得北京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（批準號2020091406-3054）。

1.2.2 甘松藥材及其提取物制備 甘松購自四川阿壩若爾蓋縣，經北京中醫(yī)藥大學石晉麗教授鑒定為敗醬科植物甘松DC.的干燥根及根莖。將藥材粉碎成粗粉，稱取300 g，依次用10、8、8倍量80%乙醇超聲提取3次，溫度控制在35 ℃以下，時間分別為60、45、45 min，靜置，濾過，合并濾液，冷凍干燥后于干燥器中保存。依據《中國藥典》2020年版和文獻方法[14]，測得甘松80%乙醇提取物中甘松新酮的質量分數(shù)為5.2%，甘松的出膏率為10.7%，即甘松生藥中含甘松新酮0.56%，符合藥典標準，見圖1。

1.2.3 試劑與儀器 甘松新酮對照品（批號 P19A10L86397，質量分數(shù)≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；DA ELISA試劑盒、3,4-二羥基苯乙酸（3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）ELISA試劑盒、高香草酸（homovanillicacid，HVA）ELISA試劑盒、5-HT ELISA試劑盒、5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindolacetic acid，5-HIAA）ELISA試劑盒、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinases 3，MAPK3）ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子- α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號202103D）購自江蘇酶免生物科技有限公司；酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗體（批號GB11181）、信號傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗體（批號GB12176）、β-actin抗體（批號GB12001）、HRP標記的山羊抗小鼠二抗（批號GB23301）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；魚藤酮（批號R105076）購自上海阿拉丁生化科技有限公司；葵花籽油（批號W24A11L122237）購自上海源葉生物科技有限公司；左旋多巴購自北京曙光藥業(yè)有限責任公司；烏拉坦（批號C10821103）購自上海麥克林生化科技有限公司。

圖1 甘松80%乙醇提取物(a) 及對照品(b) 中甘松新酮的HPLC圖

SB-5200DTD型超聲波清洗機、JY96-IIN型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；RT-6100型多功能酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司）。

1.2.4 PDA大鼠模型建立及分組、給藥 51只SD大鼠在SPF級條件下適應性飼養(yǎng)1周后，采用頸背部交替sc魚藤酮法建立PD模型。取40只大鼠sc魚藤酮葵花油溶劑（1.5 mL/kg）制備PD模型，取11只大鼠sc不含魚藤酮的葵花油溶劑作為對照組，1次/d，連續(xù)14 d。當大鼠出現(xiàn)毛色發(fā)黃、精神萎靡不振、弓背和四肢力量減弱等癥狀時，表明造模成功[19]，共得到35只PD大鼠，造模成功率為87.5%。將造模成功的PD大鼠采用曠場實驗篩選得到PDA大鼠33只。將篩選的PDA大鼠隨機分為甘松（620 mg/kg）組、左旋多巴（49 mg/kg）組和模型組，每組11只，對照組11只。各給藥組ig相應藥物（0.2 mL/kg），1次/d，連續(xù)14 d。

1.2.5 轉棒實驗 末次給藥次日進行轉棒實驗，檢測大鼠的運動狀態(tài)和平衡能力。在測試之前，先對大鼠進行為期3 d的訓練實驗，訓練時將大鼠尾朝外側放置在旋轉棒上，適應環(huán)境20 s后，將轉棒的轉速由4 r/min勻速增加至20 r/min，加速度為6 r/min，最長訓練時間為3 min。若大鼠中途掉落，將其再次放置轉棒上，確保訓練時間為3 min。正式測試時，轉速和加速度與訓練時一致，記錄大鼠第1次從轉棒上的掉落時間，每只大鼠檢測3次，每次間隔2 h，取3次測試時間的平均值[20]。

1.2.6 曠場實驗 轉棒實驗結束次日進行曠場實驗，曠場實驗為考察動物焦慮樣行為的經典實驗。將曠場（長100 cm、寬100 cm、高50 cm）放置在燈光較暗、環(huán)境安靜的場所。曠場底面為黑色，被均分為25個方格，中間的9個方格為曠場的中央區(qū)，其余為邊緣區(qū)。實驗時先將大鼠放置在空曠的環(huán)境中適應5 min，然后將其放置在曠場的中央區(qū)，并記錄大鼠在曠場5 min內的活動情況。每測試完1只大鼠，對曠場進行酒精消毒，待酒精揮發(fā)后進行下一只大鼠的測試。檢測指標為大鼠在曠場中的活動總距離（cm），以及在中央區(qū)的活動距離（cm）和停留時間（s）。

1.2.7 TH免疫組化染色 曠場實驗結束后，大鼠禁食不禁水12 h，ip 20%烏拉坦麻醉。剪開大鼠的胸腔，將灌注針插入心臟左心室，剪開右心耳進行心臟灌注操作。在冰上迅速剝離出完整的大腦，浸泡于10倍體積的多聚甲醛溶液中靜置24 h。然后進行石蠟包埋，冠狀面切片，梯度酒精脫水，染色，拍照，并將圖片導入至Image J軟件中，對陽性細胞的吸光度（）及區(qū)域總面積的比值進行分析，得到TH的平均值，以確定其表達情況。

1.2.8 紋狀體MAPK3、TNF-α含量的測定 大鼠麻醉后，在冰上迅速取出紋狀體，稱定質量，采用超聲波粉碎機進行勻漿，離心機離心，將采集到的上清液按照ELISA試劑盒說明書進行測定。

1.2.9 紋狀體STAT3蛋白表達的檢測 取各組大鼠紋狀體，使用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉30 min，加入STAT3抗體（1∶1000）和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的山羊抗小鼠二抗（1∶5000），室溫孵育30 min，然后利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)，對ECL發(fā)光檢測成像，拍照，AlphaEase FC軟件計算條帶灰度值。

1.2.10 紋狀體神經遞質水平的檢測 取各組大鼠紋狀體，采用超聲波粉碎機進行勻漿，離心機離心，將采集到的上清液按照ELISA試劑盒說明書測定DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA含量。

2 結果

2.1 甘松治療PDA的網絡分析結果

2.1.1 甘松化學成分及治療PDA的潛在靶點 通過檢索TCMSP數(shù)據庫（OB≥30%、DL≥0.18）得到4個化合物，即表1中1～4。通過文獻挖掘[21]，同時利用TCMSP考察這些化合物的OB值和DL值（OB≥30%、DL≥0.10），共得8個化合物，即表中的5～12。利用SwissTargetPrediction平臺預測出甘松潛在靶點297個。通過GeneCards數(shù)據庫得到與PDA相關的1114個作用靶點。R語言軟件對甘松化學成分和PDA的相關靶點進行分析，共獲得99個甘松治療PDA的潛在作用靶點。

表1 甘松的主要活性成分

Table 1 Main active ingredients of

序號化合物ID化合物名稱OB/%DL 1MOL010543刺槐苷39.840.71 2MOL001689金合歡素34.970.24 3MOL000358β-谷甾醇36.910.75 4MOL007088隱丹參酮52.340.40 5MOL010540甘松新酮66.340.17 6MOL004067諾卡酮33.040.10 7MOL000695廣藿香醇101.960.14 8MOL000935α-古蕓烯53.830.10 9MOL001566白菖烯52.160.11 10MOL001298去氫木香內酯58.570.14 11MOL012168馬兜鈴烯56.060.11 12MOL010534青木香酮20.690.15