湯金華，楊 軍，鞠 露 綜述，馮金洲 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016)

多發(fā)性硬化(MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性自身免疫性疾病，主要病理表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤、脫髓鞘繼而軸突破壞。發(fā)病以青少年多見，常導(dǎo)致永久性軀體功能殘疾，是30歲以下年輕人最常見的致殘性CNS疾病之一，全世界超過250 萬例患者，給家庭和社會造成沉重的負(fù)擔(dān)[1]。然而，目前MS具體發(fā)病機制未明，缺乏生物學(xué)標(biāo)志物，阻礙靶向治療的臨床應(yīng)用。目前研究表明，排斥性導(dǎo)向分子a(RGMa)可能參與CNS多種疾病的病理機制，尤其是MS的發(fā)病[2-3]。

1 RGMa分子結(jié)構(gòu)

RGMa屬糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的蛋白家族成員，最早被發(fā)現(xiàn)于雞胚胎視覺系統(tǒng)，具有軸突導(dǎo)向功能[4]。目前在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)排斥性導(dǎo)向分子(RGMs)家族成員主要有RGMa、RGMb和RGMc 3種形式，RGMa和RGMb以基本上不重疊的方式主要表達(dá)于CNS及其他組織(心臟、肺、肝臟、皮膚、免疫系統(tǒng)及小腸等)，而RGMc 僅表達(dá)于骨骼肌、肝臟和血液。RGMa基因定位于15q26.1號染色體，所編碼蛋白含450個氨基酸，具有GPI錨定的C端、N端信號肽，RGD基序及部分von Willebrand D型(vWFD)結(jié)構(gòu)域4個組成部分。RGMa以可溶性、膜結(jié)合形式存在于神經(jīng)元、髓鞘等CNS結(jié)構(gòu)[5]。

2 RGMa的信號傳導(dǎo)通路

RGMa同1型跨膜蛋白Neogenin結(jié)合，主要經(jīng)Rho-Rho激酶途徑，發(fā)揮軸突引導(dǎo)或神經(jīng)元存活、血管生成等生物學(xué)功能；RGMa的C端結(jié)構(gòu)域(C-RGMa)和RGMa的N端結(jié)構(gòu)域(N-RGMa)激活了不同的細(xì)胞內(nèi)途徑來調(diào)控上述功能：通常C-RGMa與Neogenin結(jié)合可通過Unc5和LARG激活RhoA，C-RGMa通過RhoGEF(LARG)/Rho/Rock途徑抑制軸突生長；通過黏著斑激酶(FAK)和p120 RasGAP滅活Ras，從而誘導(dǎo)生長錐塌陷[5-6]。而C-RGMa與Neogenin的結(jié)合抑制了Lrig2和Neogenin之間的相互作用，ADAM17可切割Neogenin，以使神經(jīng)元對RGMa不敏感;N-RGMa依賴于β分泌酶切割Neogenin的細(xì)胞內(nèi)部分，以生成細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合LIM蛋白4(LMO4)來阻止神經(jīng)生長[5-6]。在上皮細(xì)胞中，Neogenin結(jié)合并定位WAVE調(diào)節(jié)復(fù)合物(WRC)，導(dǎo)致肌動蛋白在Arp2/3復(fù)合體的幫助下成核并進(jìn)一步聚合為微絲，同時需要Rac1來激活和穩(wěn)定的黏附連接，該通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附連接，維持CNS發(fā)育的保真度[5]。此外RGMa作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)的共受體，可作為BMP和Neogenin之間的結(jié)構(gòu)橋，可與BMP-2、BMP-4等分子結(jié)合后通過BMP-BMP受體通路，誘導(dǎo)BMP受體復(fù)合物的內(nèi)吞作用，從而激活經(jīng)典的SMAD信號傳導(dǎo)，參與鐵代謝、骨骼發(fā)育、軸突再生等過程[7-8]。

3 RGMa的生物學(xué)活性

3.1細(xì)胞增殖與分化 RGMa與Neogenin均在腸道神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化過程中高表達(dá)，二者任一缺失會引起腸道系統(tǒng)神經(jīng)元、神經(jīng)節(jié)、膠質(zhì)細(xì)胞減少，表明RGMa參與細(xì)胞增殖與分化[9]。

3.2細(xì)胞黏附與遷移 RGMa可提高離體胚胎的細(xì)胞間黏附作用；RGMa過表達(dá)的早期胚胎的外胚層細(xì)胞出現(xiàn)遷移缺陷，表明RGMa與細(xì)胞黏附、遷移相關(guān)[8]。

3.3神經(jīng)發(fā)生與神經(jīng)管閉合 RGMa與Neogenin結(jié)合后可調(diào)節(jié)胚胎神經(jīng)發(fā)生中的分化和遷移，在體外RGMa與Neogenin可共同調(diào)節(jié)成人CNS發(fā)生[10-11]。RGMa誘導(dǎo)Neogenin蛋白水解促進(jìn)神經(jīng)管形態(tài)發(fā)生，耗竭RGMa可引起神經(jīng)管閉合缺陷[12]。

3.4調(diào)控神經(jīng)元存活 敲除齒狀回中的RGMa可增加新生神經(jīng)元的數(shù)目。有學(xué)者認(rèn)為RGMa與神經(jīng)干細(xì)胞上的Neogenin結(jié)合，通過調(diào)控caspase-3、ROCK、死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)和LMO4等調(diào)節(jié)CNS神經(jīng)元存活[10-11]。

3.5抑制突觸形成 RGMa可通過干擾皮質(zhì)神經(jīng)元中突觸前蛋白synapsin-1與突觸后蛋白PSD-95的同區(qū)域表達(dá)以阻礙突觸形成；抑制RGMa可使以上兩種蛋白的共表達(dá)提高，從而提高脊髓損傷后的突觸形成[13]。

3.6生長錐塌陷及軸突生長抑制 RGMa可能通過誘導(dǎo)RhoA和ROCK在CNS損傷后起到軸突生長抑制作用[5,14]。RGMa通過激活Rho-kinase及GSK-3β通路調(diào)控塌陷反應(yīng)介體蛋白-2(CRMP-2)的磷酸化，導(dǎo)致生長錐塌陷[15]。抑制RGMa可以促進(jìn)脊髓損傷后軸突生長和運動恢復(fù)[13,16-18]。

3.7免疫調(diào)節(jié) RGMa可通過樹突狀細(xì)胞(DCs)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和自身免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的CNS浸潤[19]。用RGMa中和抗體處理，可讓DCs發(fā)揮耐受性和免疫調(diào)節(jié)功能，降低主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ(MHC-Ⅱ)、CD86、CD80和CD40水平，從而減輕自身免疫反應(yīng)[20]。

3.8抑制新生血管形成 RGMa與血管內(nèi)皮細(xì)胞上Neogenin結(jié)合，可降低磷酸化FAK水平、下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、抑制 F-肌動蛋白，從而明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成[5,21]。RGMa在體外、體內(nèi)均可抑制血管生成[21-22]。

3.9調(diào)控血腦屏障(BBB)通透性 沉默RGMa表達(dá)可改善BBB破壞，從而減少腦梗死大鼠梗死、水腫體積，推測RGMa可能通過CDC-42/PAK-1信號通路參與了BBB功能障礙[23]。

4 RGMa在MS中的研究進(jìn)展

4.1RGMa在MS中的表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)MS動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠發(fā)病后RGMa水平明顯升高，并且在繼發(fā)進(jìn)展型MS(SPMS)小鼠模型中，處于疾病繼發(fā)進(jìn)展階段小鼠的脊髓RGMa的表達(dá)也明顯高于對照組，與急性階段的表達(dá)水平相比，仍無明顯下降，表明RGMa參與EAE小鼠的急性發(fā)病與繼發(fā)進(jìn)展[3]。DEMICHEVA等[7]發(fā)現(xiàn)SPMS患者CNS急、慢性損傷斑塊及正常樣白質(zhì)均伴有RGMa表達(dá)的顯著升高?；€血液中RGMa表達(dá)水平與MS患者隨訪擴展殘疾狀態(tài)量表(EDSS)變化呈負(fù)相關(guān)，表明血RGMa的表達(dá)與MS神經(jīng)功能缺損相關(guān)，RGMa有望作為MS臨床監(jiān)測的生物標(biāo)志物，指導(dǎo)臨床治療[2]。

4.2RGMa中和抗體在MS治療中的潛在作用 RGMa中和抗體在體內(nèi)、體外均可抑制RGMa的表達(dá)，目前多項研究表明在多種MS動物模型EAE小鼠中，RGMa中和抗體可通過阻斷RGMa改善疾病神經(jīng)功能評分，減輕髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)誘導(dǎo)的EAE的臨床嚴(yán)重性，減少髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)誘導(dǎo)的EAE的復(fù)發(fā)，抑制繼發(fā)進(jìn)展型EAE的進(jìn)展，并從多個方面改善EAE的病理反應(yīng)[3,5]。目前研究表明RGMa中和抗體可能主要從以下方面發(fā)揮治療作用。

4.2.1減輕炎性反應(yīng) 用抗RGMa抗體治療急性、慢性EAE小鼠可減少CD4+T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向CNS的入侵，減少EAE小鼠CNS中INF-γ、IL-2、IL-17、IL-4等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，減輕炎性脫髓鞘程度，抑制CNS的炎性反應(yīng)，減輕致病性Th17誘導(dǎo)的神經(jīng)元損害[3,5]。在人類中，RGMa特異性抗體可降低患有MS個體的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中的T細(xì)胞增殖和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[5,24]。

4.2.2減輕神經(jīng)變性及增強軸突與髓鞘再生 用RGMa特異性抗體對脊髓炎型EAE大鼠進(jìn)行全身治療，可增強炎性病變軸突再生的能力，并產(chǎn)生髓鞘再生跡象[7]。此外，人源化抗RGMa單克隆抗體治療繼發(fā)進(jìn)展型EAE小鼠，可保留髓磷脂，抑制脫髓鞘和軸突變性，并促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束(CST)的軸突生長和運動恢復(fù)，從而抑制疾病進(jìn)展[3]。在視神經(jīng)炎型EAE模型中，系統(tǒng)性應(yīng)用RGMa特異性抗體可顯著減少視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(RNFL)的變性[7]?？筊GMa治療有非常強的神經(jīng)保護(hù)作用。

4.3RGMa在MS中的發(fā)病機制 RGMa會高表達(dá)于MS損傷部位，通過特異性中和RGMa，神經(jīng)功能進(jìn)一步恢復(fù)，表明RGMa可作為MS有前景的生物標(biāo)志物及治療靶點[2-3]。最近研究表明RGMa在MS的病理過程中具有重要作用，但具體機制尚不確切，RGMa在MS中可能的發(fā)病機制包括以下幾方面。

4.3.1介導(dǎo)免疫細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常 在MS中，免疫細(xì)胞會滲透到CNS，其中細(xì)胞免疫發(fā)揮主導(dǎo)作用，從而導(dǎo)致脫髓鞘、軸突損傷和神經(jīng)功能障礙等[25]。CD4+T細(xì)胞是CNS炎癥的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，目前普遍將分泌INF-γ的CD4+Th1細(xì)胞作為MS異常自身免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[6]。 目前研究發(fā)現(xiàn)RGMa的阻斷抗體不但能減少T細(xì)胞的增殖，而且可增強Th1細(xì)胞向具有自身免疫抑制作用的Th2細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，RGMa在MS免疫反應(yīng)中的新作用最近備受關(guān)注[20]。

RGMa-Neogenin信號通路可參與MS中T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫過程[3]。具有較強抗原遞呈功能的骨髓來源的DCs可表達(dá)RGMa，而Neogenin由CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)，抗原遞呈細(xì)胞的RGMa與CD4+T細(xì)胞的Neogenin結(jié)合誘導(dǎo)了小GTPase Rap1的激活，從而增加了對細(xì)胞內(nèi)黏附分子1(ICAM-1)的黏附，因此，與Neogenin誘導(dǎo)的生長錐塌陷(導(dǎo)致黏附力迅速喪失)相反，RGMa和Neogenin在免疫細(xì)胞上的結(jié)合可以觸發(fā)增強的附著力，ICAM-1黏附的增加可促進(jìn)免疫細(xì)胞向MS腦的侵襲，增強CNS炎性反應(yīng)[19]。CD4+T細(xì)胞在SPMS和慢性EAE的慢性神經(jīng)炎癥中也發(fā)揮著重要作用，抗RGMa抗體治療可顯著減少繼發(fā)進(jìn)展型EAE小鼠脊髓切片中的細(xì)胞浸潤，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析確定抗RGMa抗體可減少脊髓中CD4+T細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量[3]。

目前研究發(fā)現(xiàn)RGMa在EAE中可誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，激活后的T細(xì)胞可穿透BBB,大量分泌炎性細(xì)胞因子，募集更多炎性細(xì)胞，引起CNS異常自身免疫反應(yīng)[5,24]。通過RGMa特異性抗體抑制RGMa的表達(dá)，可抑制T細(xì)胞反應(yīng)，能夠顯著減少EAE小鼠CNS中INF-γ、IL-2、IL-17、IL-4等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕脫髓鞘程度，緩解神經(jīng)功能損傷，減弱EAE的嚴(yán)重程度；在人類，RGMa特異性抗體可降低患有MS個體PBMC中的T細(xì)胞增殖和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，由此推測，RGMa-Neogenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與MS的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫過程：抗原遞呈細(xì)胞中的RGMa與Neogenin陽性的CD4+T結(jié)合，從而導(dǎo)致周圍神經(jīng)系統(tǒng)和CNS的CD4+T細(xì)胞活化[5,25]。

最近研究表明，CD4+T中產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞在EAE發(fā)病機制中也起著重要作用，IL-17、IL-17受體的缺乏會減少EAE的臨床體征，而在包括Th0、Th1、Th17和Treg細(xì)胞在內(nèi)的T細(xì)胞亞群中，Th17細(xì)胞高度表達(dá)RGMa，致病性Th17主要在MS中誘導(dǎo)神經(jīng)變性：Th17細(xì)胞的RGMa與神經(jīng)元中的Neogenin結(jié)合，通過AKT的去磷酸化誘導(dǎo)神經(jīng)變性，RGMa的中和抗體可減輕軸突變性和Th17細(xì)胞介導(dǎo)的EAE的嚴(yán)重程度[24]。

綜上，RGMa-Neogenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過DCs、CD4+T細(xì)胞(主要為Th1、Th17)在MS的異常自身免疫中占據(jù)重要作用，可作為MS免疫治療的重要靶點。

4.3.2促進(jìn)脫髓鞘 脫髓鞘在MS的病理中占據(jù)主要作用，在MS的經(jīng)典動物模型EAE小鼠中，RGMa可通過增強CD4+T細(xì)胞的活化，促進(jìn)CNS脫髓鞘[25]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)利用RGMa中和抗體抑制RGMa表達(dá)能減輕EAE小鼠的脫髓鞘水平，抑制神經(jīng)功能損傷。表明RGMa在EAE中可促進(jìn)脫髓鞘，而RGMa在MS患者中是否能發(fā)揮脫髓鞘作用及RGMa中和抗體是否可減輕MS患者的脫髓鞘情況尚需進(jìn)一步研究。

4.3.3促進(jìn)神經(jīng)變性 神經(jīng)變性是MS進(jìn)展的重要因素，在MS中極大影響神經(jīng)功能恢復(fù)，軸突生長與髓鞘再生是目前促進(jìn)MS功能恢復(fù)治療的熱點，在腦和脊髓中存在的RGMa具有強大的抑制再生活性，表明其可能在MS相關(guān)的神經(jīng)變性中起關(guān)鍵作用[7]。研究表明，具有高度炎癥活性的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在進(jìn)展性MS中起重要作用，而小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)RGMa[3]。 用RGMa特異性中和抗體5F9，可結(jié)合RGMa的N端結(jié)構(gòu)域，對脊髓炎型EAE大鼠進(jìn)行全身5F9治療，可顯著且高度可重復(fù)地改善神經(jīng)功能，減少小膠質(zhì)細(xì)胞病變的大小，增強炎性病變軸突再生的能力，可促進(jìn)脊髓灰質(zhì)損傷部位及順行追蹤的CST的軸突出芽，并產(chǎn)生髓鞘再生跡象[7,26]。對于SPMS小鼠,抗RGMa抗體治療可通過抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中RGMa表達(dá)，抑制脊髓中的軸突變性，降低脫髓鞘作用，并可通過促進(jìn)損傷部位的CST軸突發(fā)芽而發(fā)揮再生神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的能力，促進(jìn)運動功能恢復(fù)，表明RGMa很可能在MS中具有促進(jìn)軸突變性的作用，并推測可能通過RGMa-Neogenin通路發(fā)揮該作用[3]。

在20%～30%的患者中，MS的最初癥狀之一是視神經(jīng)炎，即視神經(jīng)的炎性發(fā)作，這種發(fā)作很可能會對形成RNFL的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)及其軸突產(chǎn)生重大影響[25]。 研究發(fā)現(xiàn)在視神經(jīng)炎型EAE模型中，系統(tǒng)性應(yīng)用RGMa特異性中和抗體5F9可刺激軸突再生，使再生的軸突生長為炎性病變，顯著減少RNFL的變性，對RGC發(fā)揮顯著而強大的保護(hù)作用，還顯著增加了破裂視神經(jīng)中髓磷脂堿性蛋白(MBP)+染色的面積，該表現(xiàn)可作為反映髓鞘再生的公認(rèn)標(biāo)志，這表明RGMa不僅參與軸突再生的抑制，而且參與細(xì)胞死亡的調(diào)控[7,26]。

綜上研究表明RGMa(尤其是RGMa的N端結(jié)構(gòu)域)很可能促進(jìn)MS的再生失敗與神經(jīng)退行性變，但尚需進(jìn)一步的臨床實驗來驗證RGMa在MS患者中的這一功能。

4.3.4抑制血管生成 血管生成是MS病理生理學(xué)涉及的另一個重要因素，在MS炎癥性病變中可見新血管形成，血管生成在MS疾病早期可通過消耗過多能量、促進(jìn)炎癥擴展而產(chǎn)生有害作用，但新生血管釋放的營養(yǎng)因子可能對功能恢復(fù)帶來積極作用，如源自新血管的VEGF在EAE的早期階段表現(xiàn)出促炎作用，但在EAE的晚期階段參與修復(fù)過程；從新血管中產(chǎn)生的前列腺素I2(PGI2)可促進(jìn)EAE中的運動恢復(fù)[24]。而在存在VEGF的情況下，RGMa可通過Neogenin抑制內(nèi)皮管的形成，從而抑制新血管形成，表明RGMa-Neogenin信號傳導(dǎo)途徑可通過抑制血管生成影響MS的病理過程[21]。

4.3.5調(diào)控BBB通透性 在MS中，BBB的破壞是一個明顯且早期的病理特征[27]。RGMa在CNS中具有調(diào)控BBB通透性的功能[23]。MLLER等[28]發(fā)現(xiàn)，給MS患者鞘內(nèi)注射曲安奈德，治療有效患者其神經(jīng)功能改善程度與腦脊液RGMa水平降低程度呈一致趨勢，而治療無效的患者其腦脊液RGMa水平較治療前亦無明顯改善。同時基于抑制炎性細(xì)胞浸潤、改善BBB通透性是曲安奈德治療MS的主要機制之一，推測RGMa可能通過調(diào)控MS患者BBB通透性改變參與MS的病理過程[29]。

5 結(jié)語與展望

RGMa作為一種軸突導(dǎo)向分子，通過RGMa-Neogenin、RGMa-BMPs等信號通路廣泛參與CNS發(fā)育與病理過程。RGMa具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、黏附、遷移、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)管閉合、神經(jīng)元凋亡、突觸形成、生長錐塌陷、軸突生長抑制、免疫應(yīng)答、新生血管形成、BBB通透性等生物學(xué)活性。目前研究發(fā)現(xiàn)，RGMa在MS患者和EAE小鼠的CNS中高表達(dá),并可能通過介導(dǎo)免疫細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、促進(jìn)脫髓鞘、促進(jìn)神經(jīng)變性、抑制血管生成、調(diào)控BBB通透性等途徑參與MS的發(fā)病機制。RGMa中和抗體可通過阻斷RGMa減少炎性反應(yīng)，減輕CNS異常自身免疫，減輕神經(jīng)變性及增強軸突與髓鞘再生等作用改善EAE的神經(jīng)功能，表明RGMa可能是治療MS非常有前景的靶向標(biāo)志物。但RGMa在MS中的具體發(fā)病機制及通過的具體信號通路目前尚未完全明確，缺乏RGMa相關(guān)的隨機對照臨床試驗，亟須更深入的機制與通路研究及大樣本隨機對照臨床試驗以驗證RGMa在MS中的發(fā)病機制并指導(dǎo)靶向RGMa的臨床治療。