趙春秀，王曉龍

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急救部，重慶 400010）

肺炎病原體的診斷一直是困擾臨床的問題。 從下呼吸道痰標(biāo)本培養(yǎng)到二代基因測序，均存在耗時、有創(chuàng)等問題。 呼出氣分析因其無創(chuàng)、可重復(fù)、無需專業(yè)技術(shù)人員收集等優(yōu)點，被廣泛關(guān)注。 若能研發(fā)出快速、準(zhǔn)確甄別各種病原體導(dǎo)致的肺部感染的呼出氣檢測系統(tǒng)，會有巨大應(yīng)用前景。 然而，呼出氣的成分復(fù)雜且微量，同時受口腔細(xì)菌、鼻腔細(xì)菌、飲食、運動、外界環(huán)境、收集分析技術(shù)等多種因素影響。 本文將對呼出氣的收集方法、檢測手段以及不同病原體呼出氣可能的特異性成分的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

呼出氣的收集方法

一、采樣時機

理想收集物只包含由下呼吸道產(chǎn)生的呼出氣，摒除空氣和死腔氣的干擾。收集的呼出氣體分為混合性呼出氣、呼氣后期呼出氣及肺泡呼出氣?；旌闲院舫鰵鉀]有采樣時間的限制，操作簡單，同時也存在包括環(huán)境氣體和口鼻氣污染等缺陷。呼氣后期的呼出氣摒除了呼氣的前幾秒（即死腔氣），但可能會包含死腔氣與肺泡氣的混合氣體。 肺泡呼出氣是比較理想的呼出氣樣本，完全去除死腔氣的影響，但如何控制剛好排除了死腔氣，又盡量多地收集肺泡氣是一個難題。一種簡單的方法是使用Bio-VOC 針筒來收集，受試者只需通過一次性吹嘴向這種針筒緩慢勻速地吹氣，收集到的呼氣末呼出氣可視為目標(biāo)肺泡氣。 同時，研究發(fā)現(xiàn)，利用壓力傳感器檢測呼出氣二氧化碳濃度，在到達(dá)平臺期時啟動采樣，所得樣本內(nèi)源性物質(zhì)濃度最高，這也是一種比較理想的呼出氣收集方法[1]。

二、采樣工具

機體呼出氣通過化學(xué)捕集、吸附劑捕獲和冷捕獲等技術(shù)來采集，經(jīng)預(yù)濃縮使目標(biāo)化合物濃度達(dá)到分析儀器的檢測閾值，再進(jìn)行檢測與數(shù)據(jù)處理。 分析前，呼出氣樣本多被儲存在由惰性材料構(gòu)成的聚合物袋（Tedlar 袋、鋁袋、聚酯薄膜等），然后采用含吸附劑的熱脫附（thermal desorption，TD）儀器、固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）器材或針刺捕集裝置（needle trap device，NTD）對呼出氣樣本進(jìn)行預(yù)濃縮。吸附劑作為TD 儀器進(jìn)行預(yù)濃縮的關(guān)鍵材料，需要性質(zhì)穩(wěn)定，不與分析物相互作用。 Cheng 等[2]研發(fā)了一種由細(xì)菌和真菌細(xì)胞共同組成的新型生物吸附劑，吸附量穩(wěn)定，對乙酸乙酯、α-蒎烯和正己烷的吸附性能明顯優(yōu)于其他吸附劑。Franchina等[3]對比了5 種吸附材料對細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compound，VOC）吸附的靈敏度、重復(fù)性和選擇性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tenax 的采樣性能最好，并且沒有誤判。

Tabibpour 等[4]發(fā)現(xiàn)用聚吡咯改造的碳纖維能夠優(yōu)化SPME 提取2-戊基呋喃（2-pentylfuran，2-PF）的性能，并在感染真菌患者與健康人的對照中發(fā)現(xiàn)健康人的呼出氣中缺乏2-PF，從而認(rèn)為2-PF 可能是呼吸中識別肺部真菌感染的揮發(fā)性生物標(biāo)志物。利用NTD 技術(shù)在超痕量水平分析VOC 時，可以使用D-丙酮和D-甲苯作為吸附材料的內(nèi)標(biāo)志物，這種結(jié)果的可靠性更高[5]。

呼出氣的檢測

一、分析基質(zhì)

呼出氣的分析基質(zhì)包括氣相呼出氣、 呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）和呼出氣氣溶膠（exhaled breath aerosols，EBA）。 氣相呼出氣包含大量VOC，受環(huán)境和體內(nèi)微生物代謝等多種因素影響。 EBC 是呼出氣體接觸冷凝器發(fā)生冷卻，以流體或冰凍形式收集而成，以水蒸氣和被高度稀釋的非揮發(fā)性化合物為主。EBC 中較大的分子，如細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)和病毒等，可以形成EBA，EBA 作為分析基質(zhì)的優(yōu)點在于無需經(jīng)過冷凝，便可直接收集、濾過、運輸，進(jìn)行目標(biāo)化合物分析。

二、分析方法

檢測呼出氣常用的方法包括氣相色譜（gas chromatography，GC）檢測、質(zhì)譜檢測（mass spectrometry，MS）和傳感器檢測。GC 是利用呼出氣與色譜柱的固定相物質(zhì)相互作用來鑒別呼出氣的技術(shù)，MS 是根據(jù)VOC 產(chǎn)生的離子質(zhì)荷比（m/z）對呼出氣進(jìn)行檢測的技術(shù)，臨床上多采用GC 和MS 聯(lián)合應(yīng)用，即GC-MS，這種方法提高了靈敏度和選擇性，但存在設(shè)備體積龐大、價格昂貴、專業(yè)操作知識要求高和樣品處理速度慢等缺點，且不能實現(xiàn)實時應(yīng)用。 而質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜（proton transfer reactionmass spectrometry，PTR-MS）和選擇離子流管質(zhì)譜（selected flow tube-mass spectrometry，SIFT-MS）使在線實時分析成為可能。

傳感器主要包括電子鼻和新型傳感器。 電子鼻類同于動物嗅覺，通過識別呼出氣特定的氣味指紋，結(jié)合模式識別技術(shù)甄別疾病。 Chen 等[6]使用了電子鼻的8 種機器學(xué)習(xí)算法,將呼吸機相關(guān)性肺炎患者和健康人進(jìn)行病例對照研究, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)測試集的靈敏度為79%，特異度為83%，認(rèn)為電子鼻可能是呼吸機相關(guān)性肺炎的診斷工具之一。

在新型傳感器的發(fā)展方面，有研究發(fā)現(xiàn)，將半導(dǎo)體有機層與單壁碳納米管（single walled carbon nanotube，SWCNT）結(jié)合在一起，能清晰展示呼出氣指紋[7]。 Gouma 等[8]發(fā)現(xiàn)的新型異戊二烯傳感器，是基于微系統(tǒng)的三代傳感器陣列，能快速便捷地檢測流行性感冒（流感）潛在的生物標(biāo)志物。 Shen 等[9]首次證明了因抗體修飾的磁珠能夠有效濃縮和純化病毒，故硅納米線傳感器能夠在幾分鐘內(nèi)檢測出EBC 樣本中的流感病毒。Takenaka 等[10]發(fā)現(xiàn)利用一次性的生物氣溶膠顆粒物傳感系統(tǒng)，通過熒光染料標(biāo)記EBA 顆粒，這種傳感系統(tǒng)對操作人員要求不高、快速且準(zhǔn)確，利于廣泛應(yīng)用。 近年來,有研究提出了可穿戴生物傳感器這一概念，這種傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)實時、連續(xù)、動態(tài)與快速的檢測，但目前相關(guān)研究較少。

不同肺炎呼出氣可能的特異性成分

呼出氣中不同疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的檢測可以區(qū)分引起肺部感染的不同病原微生物[11]，也可細(xì)分病原體的不同亞型[12]，有助于疾病的診斷和分型，也有利于判斷患者的預(yù)后。并且，一種病原體作用于機體會產(chǎn)生特異性的VOC，但不同病原體共同感染時釋放的物質(zhì)卻不是簡單相加，混合呼吸道感染時，不同病原體之間也存在相互作用[13]。

一、細(xì)菌

銅綠假單胞菌會釋放一種“葡萄狀”氣味分子-2-氨基苯乙酮（2-aminoacetophenone，2-AA），患者感染該菌時，2-AA 的含量會明顯升高。2-AA 可促進(jìn)病原體表型變化，抑制病原體誘導(dǎo)的炎癥，利于慢性或持續(xù)性感染，或許還能通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和骨骼肌凋亡延長感染病程[14]。感染該菌的細(xì)胞產(chǎn)生的多種揮發(fā)性代謝物在細(xì)菌的生長代謝過程中無顯著差異，但耐藥菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)不同[15]。體內(nèi)外細(xì)胞感染銅綠假單胞菌產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物也不同，這可能是該菌與體內(nèi)支氣管上皮細(xì)胞相互作用的結(jié)果[16]。 并且Koehler 等[17]發(fā)現(xiàn)體外銅綠假單胞菌DSM-50071 菌株在有氧和無氧條件產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)不一樣，分別為1-十一烯和2-十一酮。Shestivska 等[18]培養(yǎng)了36 株不同基因型的銅綠假單胞菌，通過SPME-GC-MS和SIFT-MS 檢測發(fā)現(xiàn)了硫氰酸甲酯。Montes Vidal 等[19]在革蘭陽性棘孢小單孢菌和革蘭陰性維羅納假單胞菌的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了一類新的揮發(fā)性化合物——長鏈脂肪腈。

Syhre 等[20]發(fā)現(xiàn)煙酸的衍生物（如煙酸甲酯）可能是結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌產(chǎn)生的特異性揮發(fā)物，但煙草中也含煙酸，診斷時需排除吸煙的影響。Kolk 等[21]使用GC-MS 分析了南非肺結(jié)核患者50 例與非肺結(jié)核患者50 例，發(fā)現(xiàn)利用5-己酸、1-己醇、十四酸、辛醛等共同形成的VOC 譜在鑒別結(jié)核和非結(jié)核患者時靈敏度為72%，特異度為86%。 呼出氣檢測也可用于鑒別活動性與非活動性肺結(jié)核，活動性肺結(jié)核的生物標(biāo)志物包括氧化應(yīng)激產(chǎn)物（以烷烴及其衍生物為主）和結(jié)核分枝桿菌揮發(fā)性代謝物（環(huán)己烷和苯衍生物），在活動性肺結(jié)核中可以鑒定出1,3,5-三甲苯，而在非活動性階段存在1,2,3,4-四甲苯[22]。

Neerincx 等[23]在體外研究發(fā)現(xiàn)，患者感染金黃色葡萄球菌后會出現(xiàn)1，4-戊二烯、乙醇、丙酮、2-丁酮、十一烷和2-甲基萘升高，3-羥基-2-丁酮、己醛和肉豆蔻酸異丙酯水平降低，但體外實驗的結(jié)果可能與細(xì)菌和機體的實際相互作用結(jié)果存在差異。

二、真菌

倍半萜是侵襲性真菌感染患者呼出氣中特有的揮發(fā)性物質(zhì)，是C15H24類化合物，這種物質(zhì)的代謝譜在體內(nèi)外存在差異，對診斷體內(nèi)感染具有重要意義[24]。 Bhimji 等[25]在感染侵襲性曲霉菌病免疫受損患者的EBC 中發(fā)現(xiàn)了半乳甘露聚糖（galactomannan，GM），這種物質(zhì)參與曲霉菌細(xì)胞壁的構(gòu)成。在肺曲霉菌的診斷方面，de Heer 等[26]發(fā)現(xiàn)使用Cyranose320 電子鼻檢測侵襲性肺曲霉菌病定植于肺囊性纖維化患者的靈敏度為78%，特異度為94%，并且電子鼻在區(qū)分米曲霉和煙曲霉時，具有100%的準(zhǔn)確度[27]。

三、病毒

Traxler 等[29]通過測量感染甲型流感豬的呼出氣，發(fā)現(xiàn)有6 種VOC（乙醛、丙醛、乙酸正丙酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯和1，1-二丙氧基丙烷）可能與肺部疾病進(jìn)展有關(guān)[28]。該團隊在隨后的一項體外培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，被甲型流感病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)濃度與未被感染的細(xì)胞存在差異，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)一步感染化膿性鏈球菌時，乙醛和丙醛釋放增多。 最近的一項研究[30]也認(rèn)為呼出氣檢測的諸多優(yōu)點使其有望成為更便捷、更有效的檢測新型冠狀病毒的手段。

呼出氣檢測相較于血液、支氣管肺泡灌洗液檢驗等有創(chuàng)技術(shù)，能夠避免創(chuàng)傷、提高舒適度、減輕患者心理壓力,具有良好的應(yīng)用前景。 呼出氣在線分析能減少傳統(tǒng)呼吸采樣過程中各種雜質(zhì)的干擾，但吸入氣體量、屏氣時間、漱口和周圍空氣會顯著影響在線分析的VOC 濃度。 由于呼出氣檢測暫無統(tǒng)一的實踐標(biāo)準(zhǔn)，不同的呼出氣收集方式、檢測方法之間存在差異，無可比性，加之樣本量不足，目前尚不能建立類似宏基因的數(shù)據(jù)庫。 且診斷基于表型，不能完全替代傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)和基因檢測技術(shù)，只能作為一種補充手段，或許將來能開發(fā)出一種呼出氣快檢試劑盒，利用試劑盒對肺炎病原體VOC 的高敏感性，初篩有肺炎可能的患者，再通過痰培養(yǎng)、二代基因測序等手段確定具體病原體種類。